王桂成 劉 巖

(泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院老年科一科，山東 泰安 271000)

目前中國已進入老齡化社會，老年人發(fā)生院內(nèi)和院外感染的幾率增加，引起老年人感染尤其是院內(nèi)感染的主要致病菌是G-桿菌，由G-桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素脂多糖(LPS)所造成的血管內(nèi)皮細胞的損傷能夠加重器官功能的衰竭。其中肺血管內(nèi)皮細胞損傷是LPS導致急性肺損傷(ALI)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。銀杏葉提取物(gingko biloba extrac,GbE)是一種廣泛用于治療心腦血管疾病的中成藥。GbE中黃酮類化合物、銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯以及銀杏根中的提取物銀杏內(nèi)酯M均有清除自由基作用如O2-、·OH等[2]。并且有研究[3]表明銀杏葉提取物能夠緩解由于過氧化氫所導致的內(nèi)皮細胞凋亡。本研究以大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞( pulmonary artery endothelial cells，PAECs)為研究對象，通過LPS制備細胞損傷模型，GbE進行藥物干預以探討GbE在LPS介導的RPAECs損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 Wistar大鼠，清潔級，雌雄不拘，體重300～350 g,購于山東中醫(yī)藥大學動物實驗室。在泰安市中心醫(yī)院中心實驗室標準飼料喂養(yǎng)，自由取水。

1.2檢測所需試劑及試劑盒 LPS(Sigma產(chǎn)品)、GbE(北京雙鶴藥業(yè))、MDA、LDH、SOD試劑盒(南京建成)；兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原抗血清(DAKO產(chǎn)品),華美分裝、FITC標記羊抗兔IgG，F(xiàn)ITC標記羊抗小鼠IgG(中杉金橋)、小鼠抗硝基洛氨酸單克隆抗體(Cayman)。

1.3主要儀器及器材 流式細胞儀(FACS Calibur， BD公司)，普通倒置光學顯微鏡(Olympus IX70)；熒光顯微鏡(Olympus、日本)；酶標儀(Bio-R9d 550，美國)；722分光光度計等。

1.4實驗方法

1.4.1PAECs的原代培養(yǎng)[4]10%烏拉坦按10 μl/g腹腔注射麻醉大鼠。碘伏常規(guī)消毒，打開胸腔，取下完整的心肺組織，暴露其肺動脈。眼科剪將肺動脈剪成大小約1 mm×1 mm的組織塊，以其內(nèi)膜面貼于用明膠包被過的六孔板上。放于5%、37 ℃CO2培養(yǎng)箱干涸2小時后每孔加入RPIM-1640培養(yǎng)液約3 ml，放回CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48小時后去除肺動脈組織塊即可見到有一定數(shù)量的細胞生長。

1.4.2PAECs的鑒定 倒置顯微鏡下細胞形態(tài)的觀察；免疫熒光染色：細胞涂片后甲醛固定，一抗為兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原抗血清，稀釋200倍后，鋪滿整個載玻片，置于4 ℃冰箱過夜。加入按1︰8稀釋的二抗FITC標記的羊抗兔IgG,鋪滿整個載玻片，避光30分鐘，置于熒光顯微鏡下觀察。陰性對照片一抗用PBS代替，余步驟同前。

1.4.3實驗分組 將細胞隨機分成三組，其中藥物干預組每組設三個水平，具體分組情況如下：①對照組，②LPS組(1 μg/ml)，③GbEⅠ組(10 μg/ml)，GbEⅡ組(50 μg/ml)，GbEⅢ組(100 μg/ml)。除空白對照組外其余各組均加入LPS最終濃度為1 μg/ml，與細胞共同孵育24 h后待檢。

1.4.4各項指標的檢測 嚴格按照操作說明書進行SOD、LDH、MDA、IL-8的檢測。流式細胞儀檢測細胞中NT%[1]。

2 結(jié) 果

21PAECs原代培養(yǎng)與鑒定 倒置顯微鏡下貼壁細胞呈多角形、梭形或不規(guī)則型(圖1)。融合成片的細胞呈鋪路石樣、鑲嵌狀、漩渦狀排列(圖2)。免疫熒光染色PAECs呈明亮的黃綠色熒光(圖3)。陰性對照未出現(xiàn)黃綠色熒光(圖4)。

圖1 肺動脈塊植入后72小時可見有細胞爬出(×100 )

圖2 細胞培養(yǎng)5天后細胞呈現(xiàn)鵝卵石樣排列(×100)

圖3 細胞熒光染色：PAECs呈現(xiàn)明亮黃綠色熒光(×100)

圖4 細胞熒光染色陰性對照

2.2LDH、SOD、MDA檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組LDH、SOD、MDA檢測結(jié)果

注：*為對照組、GbE組中、高藥物濃度水平與LPS組相比較LDH、MDA明顯降低，#SOD明顯升高，P均<0.05。

2.3各組間IL-8結(jié)果比較 如圖5。

圖5 各組間IL-8結(jié)果比較

注：*表示與LPS組和對照組相比，P<0.05。

2.4各組間NT%的比較 如圖6

圖6 各組間NT%的比較

注：*代表與LPS組相比較，P<0.05。

3 討 論

PAECs由于其特殊的解剖位置在肺部疾病以及心臟病的發(fā)病及發(fā)展過程中有至關(guān)重要的作用，因此研究肺動脈血管內(nèi)皮細胞的損傷與保護具有極其重要的意義。在引起PAECs損傷的原因中活性氧物質(zhì)的作用越來越受到重視，它的強氧化作用是造成細胞損傷的一個基本環(huán)節(jié)。PAECs內(nèi)既存有結(jié)構(gòu)型NO合酶基因,又有誘導型NOS基因分布。在LPS 作用下誘導型NO合酶基因表達增加使NO大量生成，而使肺血管內(nèi)皮細胞損傷、脫落[5]。在LPS損傷PAECs的過程中LPS首先與內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合，由于內(nèi)皮細胞是膜結(jié)合CD14陰性細胞，因此LBP將LPS以單體的形式轉(zhuǎn)運到可溶性CD14，在其輔助下直接作用于內(nèi)皮細胞膜上的特殊受體激活細胞。近幾年來已經(jīng)證實這種特殊受體是膜蛋白TLR4，最終激活核因子κB (NF-κB)從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，使內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)和細胞因子[6]，如NO等。NO與細胞代謝過程中生成的O2-迅速反應生成ONOO-，后者具有強氧化性，能夠?qū)е旅割?、線粒體、DNA以及細胞膜的損傷。

GbE的主要成分從銀杏葉中提取出來被廣泛應用于治療心腦血管疾病。它的主要有效成分包括銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯等。有資料[7]報道GbE具有明顯的抗氧化作用，是一種廣譜的自由基清除劑，它含有多種黃酮，如山奈酚和皮質(zhì)素均能捕捉和清除超氧自由基包括O2-、·OH、NO等。通過測定未反應的超氧陰離子及其清除程度來測定SOD活性，證明GbE有直接清除O2-，即GbE具有SOD的作用。本研究中, GbE組各藥物濃度水平干預后的細胞培養(yǎng)上清中MDA、LDH含量較LPS組顯著降低，SOD明顯上升(P均<0.05)，說明GbE能夠起到抗氧化、清除自由基的作用。GbE組IL-8明顯降低，說明GbE能夠顯著降低細胞的炎性反應，減輕細胞損傷，GbE組中NT%較LPS組明顯降低(P<0.05),說明GbE顯著降低了由于LPS導致的ONOO-的生成，間接反映了NO的生成減少，ONOO-的生成減少能夠降低它的強氧化性，從而有效的保護內(nèi)皮細胞。

綜上所述，應用GbE進行藥物干預能夠降低由LPS介導的大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞的損傷，這種保護主要是通過GbE通過抑制NO的生成、清除氧自由基，而起到抗氧化作用。本研究為臨床內(nèi)毒素損傷內(nèi)皮細胞問題提供了新的治療思路。

[1] 谷振勇,凌亦凌.肺動脈內(nèi)皮細胞生成過氧亞硝基陰離子的意義[J].中國應用生理學雜志,2009,17(4):125-128.

[2] Tapping RI, Gegner JA, Kravchenk VV, et al. Antagonistic effects of extract from leaves of Ginkgo biloba on glutamate neurotoxicity [J].Prog Clin BiolRes, 2008:156-158.

[3] Da Silva Correia J, Uleritch RJ. MD-2 and TLR4 N-linked glycosylations are important for a functional lipopolysaccharide receptor [J]. J Biol Chem, 2007, 277(3): 1845-1847.

[4] Ozinsky A, Underhill DM, Fontenot JD, et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll like receptors [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 97 (25): 13766-13771.

[5] 周衛(wèi)東,章如新,李兆基,等.豚鼠鼻粘膜一氧化氮合酶表達[J].中華耳鼻咽喉科雜志,2001,36(1):64-65.

[6] Da Silva Correia J, Uleritch RJ.MD-2 and TLR4 N-linked glycosylations are important for a functional lipopolysaccharide receptor[J] .J Biol Chem, 2009, 277(3):1845-1847.

[7] Packer L. Antioxidant action of Ginkgo biloba extract (EGb 761)[J]. Food Free Radicals, 2006, 21(5): 75-78.