孫維洋 李劍芳 邱進(jìn) 徐凌川

[摘要] 目的：利用RAPD技術(shù)分析野生單葉蔓荊（Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham.）種質(zhì)資源的遺傳多態(tài)性及種內(nèi)遺傳差異。方法：本研究以7個不同產(chǎn)區(qū)的野生蔓荊為試材，采用RAPD技術(shù)對其遺傳物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)合NTSYS-2.10e軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算和UPGMA方法聚類分析。結(jié)果：10個隨機(jī)引物共獲得88條DNA譜帶，其中46條（52.3%）具有多態(tài)性；采用CTAB法提取DNA時，先將試材在0.9%的蔗糖溶液中暗培養(yǎng)48 h，有利于提高DNA提取率和純度。結(jié)論：各種質(zhì)之間均存在一定的遺傳差異，與地域關(guān)系和主要有效成分的化學(xué)差異并不一致，尚需進(jìn)一步的植物逆境生理和功能基因組學(xué)研究來解釋這一現(xiàn)象。

[關(guān)鍵詞] 單葉蔓荊；遺傳多樣性；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性

[中圖分類號] R949.95 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1673-7210（2011）11（c）-005-03

Analysis on genetic polymorphism in germplasm materials of Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham. by RAPD

SUN Weiyang, LI Jianfang, QIU Jin, XU Lingchuan

School of Pharmacy, Shandong University of TCM, Shandong Province, Ji'nan 250355, China

[Abstract] Objective: To study genetic polymorphism in germplasm materials of wild Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham. and species differences of the genetic by RAPD. Methods: 7 wild germplasms of Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham. from different areaes were analyzed in this study. RAPD was used to analyze the genetic material, and the NTSYS-2.10e software was used to calculate the genetic similarity coefficient, the UPGMA method was used to do the clustering analysis. Results: 88 DNA bands were amplified with 10 primers, 46 of which (52.3%) were polymorphic. Culturing the plant materials in 0.9% sucrose solution in darkness for 48 h before using the CTAB to extract DNA could greatly improve the yield and purity of DNA. Conclusion: There are certain genetic differences in all kinds of quality, which is not accordance to the regional relations and the chemical difference of major effective component. The reason of this phenomenon still needs to be further plant stress physical and functional genomics research to explain.

[Key words] Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham.; Genetic polymorphism; RAPD

單葉蔓荊（Vitex trifolia L.var. simplicifolia Cham.）的干燥成熟果實(shí)為我國傳統(tǒng)中藥材蔓荊子的來源之一，蔓荊子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，在我國已有2 000余年的栽培和藥用歷史，有疏散風(fēng)熱、清利頭目之功效，用于治療風(fēng)熱感冒、頭痛、齒齦腫痛、目赤多淚、目暗不明、頭暈?zāi)垦５萚2]。單葉蔓荊主產(chǎn)于山東、江西等省，而蔓荊子的另外一種藥源植物蔓荊（Vitex trifolia L.）則主要分布在廣西等地。近年來，隨著各地引種栽培活動的頻繁以及規(guī)范化種植的需要，對蔓荊子種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究日益受到人們的關(guān)注。運(yùn)用顯微鑒別方法、薄層色譜和紫外吸收光譜法可以辨別蔓荊子及其混淆品牡荊子[3]，而利用掃描電鏡法可以區(qū)分單葉蔓荊和蔓荊，但是種內(nèi)的遺傳多樣性不明顯[4]。1990年美國杜邦公司農(nóng)產(chǎn)品研究中心的Williams等[5]第一次用隨機(jī)排列的10堿基寡核苷酸作為單引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA片段獲得成功，他們稱之為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)。Nakai等[6]用RAPD技術(shù)對淫羊藿屬8種植物進(jìn)行了DNA分析，此后，應(yīng)用RAPD技術(shù)對藥材道地性的研究逐漸增多，RAPD技術(shù)以其快速、微量、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠且不受生育階段、供試部位、環(huán)境條件、儲藏因素等的影響，在中藥分類、鑒定研究中展示了廣闊的應(yīng)用前景。本研究采用RAPD技術(shù)對7個不同產(chǎn)地的野生單葉蔓荊進(jìn)行了遺傳多樣性分析。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

來源于不同居群的野生蔓荊于2009年8月份定植于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥圃內(nèi)，分別編號為V1～V7，不同居群蔓荊的產(chǎn)地及生長環(huán)境，見表1。蔓荊株行距1 m×1.2 m，于2010年7月份每居群選取1株，每株剪取15 cm左右長度的新梢3支，于濃度0.9%的蔗糖水溶液中暗培養(yǎng)48 h，取葉片以去離子水洗凈，拭干。

1.2 儀器與試劑

Eppendorf Mastercycler gradient PCR儀；Universal HoodⅡ型紫外凝膠成像系統(tǒng)；RAPD隨機(jī)引物（購于濟(jì)南博亞生物技術(shù)有限公司，長度為10 bp）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總DNA的提取

DNA提取參照CTAB法[7]，各樣品取少量葉片（約0.1 g），置于1.5 ml離心管中，液氮充分冷凍，用預(yù)冷的塑料研杵迅速充分研磨至粉狀。每管加入800 μl的2% CTAB抽提緩沖液[0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.02 mol/L EDTA（pH 8.0）、1.5 mol/L NaCl（pH 8.0）、2%CTAB（W/V）]，輕輕搖動混勻，置于60℃水浴中，約10 min搖動1次，30 min后取出；冷卻2 min后，加入氯仿至滿管，劇烈震蕩3 min，輕輕顛倒混勻；12 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)至裝有800 μl預(yù)冷異丙醇的EP管中，輕輕顛倒混勻，靜置5 min。吸出上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，吹干，用50 μl 0.5×TE緩沖液（含Rnase）溶解，37℃放置15 min，BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀測定DNA樣品濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 隨機(jī)引物的篩選

按照各模板DNA的濃度計(jì)算所取體積，最終配置該含有等濃度7種DNA樣品的混合樣品（Pool），對160個隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，得到10個條帶較多且清晰、多態(tài)性較好的引物。見表2。

2.3 擴(kuò)增

RAPD-PCR反應(yīng)體積為25 μl，其中包括1×buffer、2.5 mmol/L MgCl2、100 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、1 U Taq酶及30 ng模板DNA。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃預(yù)變性30 s，40℃預(yù)變性60 s，72℃預(yù)變性90 s，40個循環(huán)；72℃預(yù)變性5 min；4℃保存。

2.4 RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

從上述10個條帶中隨機(jī)選取兩個引物進(jìn)行PAPD擴(kuò)增產(chǎn)物檢測，即P20和P27。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μl上述緩沖液，混勻，于含0.05%溴化乙錠的0.7%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，電極緩沖液為0.5×TBE，電壓為5 V/cm，Maker 2 000為參照，用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，電泳結(jié)果見圖1。

2.5 數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)

RAPD為顯性標(biāo)記，同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性。將PCR擴(kuò)增的DNA電泳條帶作為位點(diǎn)記錄下來，若某個擴(kuò)增條帶在一個樣品中出現(xiàn)，記作“1”，未出現(xiàn)的記作“0”。原始數(shù)據(jù)的整理采用Excel軟件，利用NTSYS-2.10e軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算和UPGMA方法聚類分析，結(jié)果分別見表3和圖2。

3 討論

3.1 蔓荊基因組DNA的提取

在提取DNA之前，新梢和葉片在0.9%的蔗糖水溶液中暗培養(yǎng)48 h可以降低淀粉、色素等干擾物質(zhì)對DNA提取的干擾。本研究采用CTAB小量法提取DNA，所得基因組DNA的提取率和純度都比較高，對DNA樣品進(jìn)行RAPD擴(kuò)增分析，結(jié)果表明，這些DNA樣品均可以擴(kuò)增出譜帶，且擴(kuò)增帶型清晰度較高，有效地排除了葉綠素及次生代謝產(chǎn)物對PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響。另外模板中殘留的氯仿、異丙醇等小分子有機(jī)物會影響Taq酶活性，為了得到純度較高、有保證的擴(kuò)增結(jié)果，最好用70%乙醇抽提2～3次，然后以含Rnase的TE緩沖液溶解，排除樣品中少量RNA的影響。因?yàn)樘崛∵^程中各重復(fù)結(jié)果之間也會出現(xiàn)一定的差別，所以在使用之前每管所得DNA模板都必須在測定濃度之后，根據(jù)濃度確定PCR所需模板DNA溶液的體積，否則可能會導(dǎo)致條帶不清晰、假陽性等異常結(jié)果。

3.2 各產(chǎn)地野生蔓荊RAPD標(biāo)記遺傳多樣性

本實(shí)驗(yàn)利用RAPD分子標(biāo)記對我國蔓荊子主要產(chǎn)地山東、江西、安徽等7個地區(qū)的野生蔓荊進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，從160條RAPD引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的引物10條（表1）。RAPD擴(kuò)增的條帶在250～2 500 bp之間，10條引物共擴(kuò)增出88條帶，多態(tài)性條帶為46條，多態(tài)性比率為52.3％。

由聚類分析（圖2）可見，各種質(zhì)之間均存在一定的遺傳差異，7個樣本大致可以分為4組，在相似系數(shù)0.84的水平上V3和V5聚為一組，V6和V7聚為一組，而在0.80的水平上V1和V2聚為一組，V4單獨(dú)一組。說明V3和V5、V6和V7相似系數(shù)較高，V1和V2次之，另外，V1、V2、V3、V5之間的遺傳相似性較強(qiáng)，而它們與V4、V6、V7的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。這種遺傳關(guān)系可能是在人工引種的基礎(chǔ)上[8]，由長期的自然變異導(dǎo)致的，尚需進(jìn)一步的考證。

3.3 小結(jié)

根據(jù)吳永忠等[9]的報道，其測定的樣品中山東牟平姜格莊、江西星子蓼花和江西都昌多寶與本研究所采樣品在地域分布上相距較近，可以認(rèn)為是來自相同產(chǎn)區(qū)的樣品；研究發(fā)現(xiàn)，江西兩地所產(chǎn)蔓荊子藥材中蔓荊子黃素含量為0.218 9%和0.197 6%，是山東牟平所產(chǎn)蔓荊子含量（0.074 3%）的2~3倍。而本研究結(jié)果顯示，V2（山東牟平）與V5（江西多寶）之間的遺傳相似性要高于V5與V6（江西都昌）之間的遺傳相似性，是什么因素導(dǎo)致了蔓荊子化學(xué)多樣性與其種質(zhì)的遺傳多態(tài)性之間的差異呢？初步判斷可能由以下原因造成：第一，RAPD分析的遺傳多態(tài)性并不一定能夠體現(xiàn)相關(guān)化學(xué)成分合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)差異，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，各種質(zhì)之間均具有一定程度的遺傳差異，但所有的種質(zhì)之間的最大遺傳差異為0.307（表3中V7與V2、V4的交叉處），這充分說明對于蔓荊而言種內(nèi)的遺傳關(guān)系總體來說是較近的，而少量遺傳物質(zhì)的差異是否直接與相關(guān)化學(xué)成分的合成有關(guān)還不得而知；第二，環(huán)境因素對相關(guān)化合物含量的影響可能大于遺傳距離的影響，干旱、鹽堿等脅迫條件是否促進(jìn)了植物的逆境應(yīng)答，在應(yīng)答機(jī)制里面相關(guān)成分是否起到了重要作用。以上研究都與植物逆境生理及植物功能基因組學(xué)有著密切的關(guān)系，這些問題的解答必將促進(jìn)藥用植物化學(xué)多樣性與遺傳多態(tài)性的關(guān)系研究，同時為藥材資源的整理、創(chuàng)新以及規(guī)范化栽培提供科學(xué)參考。

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[8]靳光乾,張卉,劉善新,等.不同產(chǎn)地蔓荊子種子質(zhì)量研究[J].種子,2007,26(4):66-68.

[9]吳永忠,朱良輝,肖明,等.不同產(chǎn)地蔓荊子化學(xué)成分含量比較[J].中藥材,2000,23(10):616-619.

（收稿日期：2011-06-16）

[基金項(xiàng)目] 山東省教育廳項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：J08LG19）。

[作者簡介] 孫維洋（1974-），山東昌邑人，副教授；研究方向：分子生藥學(xué)。