王蓮 魏玲 付莉

[摘要] 目的：應(yīng)用Fluoro-Jade C（FJC）染色方法在小鼠匹羅卡品癲癇模型中探測(cè)紋狀體結(jié)構(gòu)中神經(jīng)元的變性情況，以了解紋狀體結(jié)構(gòu)在慢性顳葉癲癇發(fā)生中的病理神經(jīng)基礎(chǔ)。方法：雄性昆明小鼠10只（對(duì)照組5只，模型組5只）。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后3 d處死模型組小鼠。在紋狀體水平切制冠狀切片，行FJC染色，在熒光顯微鏡下觀察FJC陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)和在紋狀體（尾狀殼核）中的整體分布情況。結(jié)果：在模型組，F(xiàn)JC染色的腦切片上清楚顯示FJC陽(yáng)性變性細(xì)胞呈亮黃綠色，呈神經(jīng)元形態(tài)，胞體和突起均清晰顯示。在紋狀體（尾狀殼核）內(nèi)背側(cè)1/3和尾側(cè)部分出現(xiàn)許多FJC陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)論：本研究運(yùn)用FJC染色技術(shù)在小鼠匹羅卡品癲癇模型中顯示紋狀體中發(fā)生了神經(jīng)元變性，提示紋狀體可能在慢性顳葉癲癇的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] Fluoro-Jade C；癲癇；匹羅卡品；神經(jīng)變性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R742.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1673-7210（2011）11（c）-021-03

Fluoro-Jade C staining in the assessment of neurodegeneration in the striatum of Pilocarpine-treated mice

WANG Lian, WEI Ling, FU Li

Local Cadres Ward, Kunming General Hospital of Chengdu Military Region, Yunnan Province, Kunming 650032, China

[Abstract] Objective: To detect degenerative neurons by Fluoro-Jade C (FJC) that may occurred in the striatum of pilocarpine-treated mice and to understand the pathologically neural basis of striatum in chronic epilepsy. Methods: Male adult mice (Kunming stain, n=10) were divided into Pilocarpine-treated group (n=5) and control group (n=5). Pilocarpine-treated mice were sacrificed at 3 d after status epilepticus. Brain coronal sections in the striatum levels were subject to FJC staining. Finally, FJC-stained brain and overall distribution of the Fluoro-Jade C positive cells sections were examined under an epifluorescence microscope to identify the shape in the striatum (caudate putamen). Results: The FJC-positive staining cells showed a bright green color in the somas and fine processes with neuronal profiles. Numerous degenerating cells could be seen in the medial dorsal one-third and caudal part of the striatum (caudate putamen). Conclusion: Massive neurodegeneration are demonstrated by FJC staining in the striatum of Pilocarpine-treated mice, suggesting that the striatum may play a role in recurrent seizure mechanism of chronic epilepsy.

[Key words] Fluoro-Jade C; Epilepsy; Pilocarpine; Neurodegeneration

顳葉癲癇是人類(lèi)癲癇的常見(jiàn)形式，治療難度大，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍有許多問(wèn)題有待解決。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中許多關(guān)鍵性區(qū)域涉及顳葉癲癇的發(fā)作，如基底節(jié)在癲癇活動(dòng)的啟動(dòng)和傳播方面起重要作用[1]。在本研究中筆者應(yīng)用新近發(fā)展的一類(lèi)陰離子熒光配體組化染料Fluoro-Jade C（FJC，特異性標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)中正在變性的神經(jīng)元[2-4]）和小鼠匹羅卡品顳葉癲癇模型研究了紋狀體神經(jīng)元的變性情況，深入了解慢性顳葉癲癇中癲癇反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性昆明小鼠10只，鼠齡4～5周，體重20～25 g。試劑鹽酸匹羅卡品（P6503）購(gòu)自Sigma公司，使用前溶于生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為10 mg/ml的溶液；硫酸阿托品注射劑（規(guī)格1 ml：0.5 mg；批號(hào)：091203）購(gòu)自太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司，配置成質(zhì)量濃度為0.25 mg/ml的溶液；苯巴比妥鈉注射液（規(guī)格1 ml：0.1 g；批號(hào)：100701）購(gòu)自上海新亞藥業(yè)有限公司；FJC（AG325）購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司。染液配制：用5%的NaOH溶液20 ml和100%乙醇80 ml配制成1%NaOH-80%乙醇混合液；用0.03 g高錳酸鉀和50 ml蒸餾水配制成0.06%高錳酸鉀溶液；10 ml蒸餾水和0.01 g FJC粉劑配制成質(zhì)量濃度為0.1%的FJC儲(chǔ)存液；用10 ml蒸餾水、10 μl 0.1% FJC儲(chǔ)存液和10 μl醋酸液稀釋成0.000 1% FJC工作液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將10只小鼠隨機(jī)分為兩組，每組5只，其中一組采用阿托品和生理鹽水腹腔注射（對(duì)照組），另一組給予阿托品和匹羅卡品腹腔注射（模型組）。模型組小鼠在注射匹羅卡品前15 min，先腹腔注射阿托品（1 mg/kg），后腹腔注射匹羅卡品（首次量220 mg/kg），若未出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE），則每隔30 min追加注射（每次1/3首次量），最終制成SE模型小鼠。癲癇發(fā)作嚴(yán)重性參照Racine分級(jí)：凝視不動(dòng)為Ⅰ級(jí)，姿勢(shì)僵硬為Ⅱ級(jí)，頭部顫動(dòng)及重復(fù)動(dòng)作為Ⅲ級(jí)，后腿站立及肌陣攣為Ⅳ級(jí)，嚴(yán)重強(qiáng)直陣攣發(fā)作為Ⅴ級(jí)。在本實(shí)驗(yàn)中用于組織切片制備的是表現(xiàn)Ⅲ~Ⅳ級(jí)發(fā)作的小鼠。SE后60 min，腹腔注射苯巴比妥（45 mg/kg）終止SE；SE后2 h，腹腔注射生理鹽水（0.8～1.0 ml/只）。在對(duì)照組，用等體積的生理鹽水代替匹羅卡品，其他同模型組。生理鹽水處理的小鼠無(wú)癲癇活動(dòng)出現(xiàn)。

1.3 組織制備

小鼠通過(guò)經(jīng)心灌注固定處死，模型組小鼠在SE后3 d時(shí)處死，對(duì)照組小鼠也在3 d時(shí)處死。腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）深度麻醉小鼠，開(kāi)胸，經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管，生理鹽水（15 ml）灌注，然后用40 ml質(zhì)量濃度4%多聚甲醛溶液先快后慢灌注固定。取鼠腦在4℃條件下置多聚甲醛溶液中后固定，最后將鼠腦置于質(zhì)量濃度20%蔗糖溶液在4℃條件下沉底。用O.C.T.復(fù)合物包埋腦組織、冰凍，在紋狀體水平用恒冷箱冰凍切片機(jī)切制厚14 μm的冠狀切片，貼于涂有明膠的載玻片上，晾干后進(jìn)行FJC染色。

1.4 FJC染色

切片按先后順序置于1%NaOH-80%乙醇混合液5 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min，0.06%高錳酸鉀溶液10 min，蒸餾水2 min。取出切片后將0.000 1% FJC染液滴于切片上反應(yīng)10 min（避免強(qiáng)光照射），再將切片用蒸餾水漂洗3次（1 min/次），晾干，二甲苯透明1 min。用中性樹(shù)膠封片后在Olympus BX60熒光顯微鏡下采用藍(lán)色濾色片觀察并采集圖像。組織結(jié)構(gòu)和命名參照Paxinos和Franklin的小鼠圖譜[5]。

2 結(jié)果

2.1 FJC陽(yáng)性變性神經(jīng)元的形態(tài)

在模型組，F(xiàn)JC染色的腦切片上染色背景很淺，F(xiàn)JC陽(yáng)性變性細(xì)胞呈亮黃綠色，呈神經(jīng)元形態(tài)，胞體和突起均清晰顯示（圖1）。在對(duì)照組未見(jiàn)FJC陽(yáng)性細(xì)胞。

2.2 腦結(jié)構(gòu)變化和FJC陽(yáng)性變性神經(jīng)元在紋狀體的分布

在模型組，發(fā)生SE的小鼠側(cè)腦室和第三腦室擴(kuò)大。紋狀體（尾狀殼核）內(nèi)背側(cè)1/3和尾側(cè)部分見(jiàn)到許多FJC陽(yáng)性細(xì)胞（圖2）。

3 討論

確定皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)特定區(qū)域在癲癇發(fā)作中的作用能更好地了解癲癇的發(fā)生機(jī)制和行為損害，也有利于為癲癇的預(yù)防和治療提供靶點(diǎn)[6]。許多關(guān)鍵腦區(qū)參與癲癇活動(dòng)的產(chǎn)生和傳播[7]。在本研究中，筆者應(yīng)用一種陰離子熒光配體即FJC在昆明小鼠匹羅卡品顳葉癲癇模型中探測(cè)變性細(xì)胞，結(jié)果顯示在紋狀體（尾狀殼核）內(nèi)背側(cè)1/3和尾側(cè)部分發(fā)現(xiàn)許多FJC陽(yáng)性細(xì)胞，提示了SE后在這些區(qū)域發(fā)生了神經(jīng)元變性。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示，皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)在癲癇發(fā)作的行為學(xué)表現(xiàn)、癲癇活動(dòng)的擴(kuò)布甚至啟動(dòng)方面起作用[8]?；坠?jié)是感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)和邊緣系統(tǒng)之間的交通中心，參與運(yùn)動(dòng)性癲癇到執(zhí)行靶點(diǎn)的傳播及邊緣結(jié)構(gòu)中癲癇活動(dòng)的產(chǎn)生[9]。紋狀體是基底節(jié)的接受部分，接受來(lái)自大腦皮質(zhì)的輸入。皮質(zhì)紋狀體興奮性谷氨酸傳導(dǎo)調(diào)節(jié)紋狀體內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)[4]。腹側(cè)杏仁核傳出通路直接從杏仁體投射到腹側(cè)紋狀體，其中一些密集地投射到殼核和蒼白球[8]。

自19世紀(jì)開(kāi)始，基底節(jié)在前腦癲癇傳播中的作用引起了相關(guān)專(zhuān)家的興趣。Turski等[9]應(yīng)用系統(tǒng)注射匹羅卡品誘發(fā)邊緣性癲癇來(lái)研究基底節(jié)內(nèi)調(diào)節(jié)癲癇發(fā)作閾值的神經(jīng)元途徑，在尾狀核和殼核中雙側(cè)微注射興奮性氨基酸衍生物N-甲基-D-天（門(mén)）冬氨酸（當(dāng)注射入大腦皮質(zhì)、杏仁核或海馬時(shí)為強(qiáng)有力的致驚厥劑）時(shí)可拮抗匹羅卡品誘導(dǎo)的邊緣性癲癇。這種抗驚厥作用在整個(gè)尾狀核-殼核均可觀察到，但是尾狀核-殼核的腹后部分作用最顯著。通過(guò)雙側(cè)微注射神經(jīng)興奮毒素鵝膏蕈氨酸來(lái)?yè)p害尾狀核-殼核則使匹羅卡品的致癲用量減少。通過(guò)阻斷黑質(zhì)網(wǎng)狀部或腳內(nèi)核內(nèi)的γ-氨基丁酸（GABA）介導(dǎo)的抑制可使尾狀核-殼核的抗驚厥作用逆轉(zhuǎn)。結(jié)果提示尾狀核-殼核及其GABA依賴(lài)的傳出途徑調(diào)節(jié)邊緣結(jié)構(gòu)的癲癇發(fā)作閾值。

臨床影像學(xué)研究也顯示，在顳葉癲癇患者發(fā)作期間常觀察到尾狀核、殼核和丘腦出現(xiàn)發(fā)作期高灌注。此觀察和術(shù)后同側(cè)尾狀核代謝減低的研究提示在顳葉和紋狀體之間有共同的功能聯(lián)系[10]?；坠?jié)和額顳葉之間有許多聯(lián)系，因此基底節(jié)的高灌注可能是經(jīng)皮質(zhì)紋狀體連接由皮質(zhì)灶繼發(fā)皮質(zhì)下激活所致[11]。用發(fā)作期單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層減影和磁共振成像配準(zhǔn)[subtraction ictal single-photon-emission computed tomography（SPECT）coregistered to magnetic resonance imaging（MRI），SISCOM]復(fù)合技術(shù)對(duì)顳葉內(nèi)側(cè)癲癇患者的研究資料最常顯示在前顳區(qū)出現(xiàn)發(fā)作時(shí)高灌注，并常同時(shí)累及基底節(jié)和島葉，這可能代表了癲癇傳播的主要區(qū)域，可能是由于致癲灶觸發(fā)的神經(jīng)元過(guò)度活動(dòng)擴(kuò)展所致[11-12]。另外，因?yàn)榧y狀體和丘腦通過(guò)穹隆和乳頭體接受來(lái)自海馬和杏仁核的大量纖維支配，所以海馬的細(xì)胞喪失導(dǎo)致了到同側(cè)紋狀體和丘腦的輸出減少，因此在顳葉癲癇患者出現(xiàn)皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)低代謝。對(duì)頑固性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇患者進(jìn)行基于像素的形態(tài)定量研究顯示中腦、皮質(zhì)下核（如丘腦和尾狀核）及頂枕區(qū)顯示灰質(zhì)密度降低[10]。這提示在功能和解剖上與海馬聯(lián)系的腦區(qū)出現(xiàn)容積縮小。Geary等[8]的研究也顯示了相似的結(jié)果。

總之，本研究不僅證實(shí)FJC在檢測(cè)神經(jīng)元變性方面敏感、可靠、簡(jiǎn)單，而且提示紋狀體可能在慢性顳葉癲癇的發(fā)生機(jī)制中起重要作用，從治療干預(yù)的可能性角度考慮，這有助于探測(cè)神經(jīng)保護(hù)措施以預(yù)防或減輕癲癇發(fā)作。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Joo EY, Tae WS, Hong SB. Regional effects of lamotrigine on cerebral glucose metabolism in idiopathic generalized epilepsy [J]. Arch Neurol,2006,63(9):1282-1286.

[2]Schmued LC, Stowers CC, Scallet AC, et al. Fluoro-Jade C results in ultra high resolution and contrast labeling of degenerating neurons [J]. Brain Res,2005,1035(1):24-31.

[3]Ehara A, Ueda S. Application of Fluoro-Jade C in acute and chronic neurodegeneration models: utilities and staining differences [J]. Acta Histochem Cytochem,2009,42(6):171-179.

[4]Wang R, Ma WG, Gao GD, et al. Fluoro jade-C staining in the assessment of brain injury after deep hypothermia circulatory arrest [J]. Brain Res,2011,1372:127-132.

[5]Paxinos G, Franklin KBJ. The mouse brain in stereotaxic coordinates [M]. New York: Academic Press,2001:28.

[6]Blumenfeld H, Varghese GI, Purcaro MJ, et al. Cortical and subcortical networks in human secondarily generalized tonic-clonic seizures [J]. Brain,2009,132(Pt 4):999-1012.

[7]McIntyre DC, Kelly ME. The parahippocampal cortices and kindling [J]. Ann N Y Acad Sci,2000,(911):343-354.

[8]Geary EK, Seidenberg M, Hermann B. Atrophy of basal ganglia nuclei and negative symptoms in temporal lobe epilepsy [J]. J Neuropsychiatry Clin Neurosci,2009,21(2):152-159.

[9]Turski L, Meldrum BS, Cavalheiro EA, et al. Paradoxical anticonvulsant activity of the excitatory amino acid N-methyl-D-aspartate in the rat caudate-putamen [J]. Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(6):1689-1693.

[10]Joo EY, Hong SB, Han HJ, et al. Postoperative alteration of cerebral glucose metabolism in mesial temporal lobe epilepsy [J]. Brain,2005,128(Pt 8):1802-1810.

[11]Amorim BJ, Etchebehere EC, Camargo EE, et al. Statistical voxel-wise analysis of ictal SPECT reveals pattern of abnormal perfusion in patients with temporal lobe epilepsy [J]. Arq Neuropsiquiatr,2005,63(4):977-983.

[12]Kaiboriboon K, Bertrand ME, Osman MM, et al. Quantitative analysis of cerebral blood flow patterns in mesial temporal lobe epilepsy using composite SISCOM [J]. J Nucl Med,2005,46(1):38-43.

（收稿日期：2011-07-26）

[作者簡(jiǎn)介] 王蓮，女，博士，主治醫(yī)師；研究方向：癲癇。