倪斌 胡華軍

[摘要] 目的：制備CdTe/ZnSe核殼量子點標(biāo)記卵清白蛋白（OVA）探針OVA-CdTe/ZnSe，并檢測其特異性熒光示蹤作用。方法：將CdTe/ZnSe核殼量子點與OVA偶聯(lián)制備熒光探針，通過凝膠電泳和光譜分析鑒定偶聯(lián)效果；然后示蹤OVA致敏的小鼠外周血嗜堿粒細(xì)胞（BASO）表面IgE高親和力受體FcεRI。結(jié)果：偶聯(lián)OVA后的量子點分子量增加，熒光增強(qiáng)且熒光峰位從628 nm紅移至635 nm。通過激光共聚焦顯微鏡能清晰觀測到OVA-CdTe/ZnSe探針對BASO表面IgE-FcεRI復(fù)合物的熒光標(biāo)記。結(jié)論：OVA-CdTe/ZnSe探針能示蹤OVA特異性IgE-FcεRI復(fù)合物，此探針在OVA致敏動物模型的特異性IgE檢測中具有一定應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞] CdTe/ZnSe核殼量子點；免疫熒光標(biāo)記；雞卵清白蛋白；IgE

[中圖分類號] R392-3[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1673-7210（2011）11（c）-019-03

Preparation and fluorescence-imaging application of OVA-CdTe/ZnSe core/shell quantum dots

NI Bin, HU Huajun*

Department of Pharmacy, College of Life Science, China Jiliang University, Zhejiang Province, Hangzhou310018, China

[Abstract] Objective: To establish a method to detect the IgE-FcεRI on BASO cells by using CdTe/ZnSe core/shell quantum dots(QDs) immuno-fluorescence labeling technology. Methods: CdTe/ZnSe core/shell QDs were coupled to the OVA with N-hydroxysuccinimide (NHS). After confirmation by agarosegel electrophoresis method and spectra analysis, the coupled product (OVA-CdTe/Znse) was used to detect the IgE-FcεRI on BASO cells. Results: Spectra analysis showed that the fluorescence intensity of OVA-CdTe/Znse was enhanced and the emission peak underwent a red-shift from 628 nm to 635 nm. Confocal fluorescence microscopy further showed that OVA-IgE-FcεRI on BASO cells characterized by the red fluorescence. Conclusion: OVA-CdTe/Znse fluorescence probes can effectively recognize IgE-FcεRI on BASO cells, which can be used in allergic animal model for detecting OVA specific IgE.

[Key words] CdTe/ZnSe core/shell quantum dots; Immuno-fluorescence labeling; OVA; IgE

支氣管哮喘（bronchial asthma，簡稱哮喘）屬于過敏性疾病的一種，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前全球約有3億哮喘患者，被WHO列為四大頑癥之一。鑒于人體試驗的局限性，對哮喘的干預(yù)研究往往通過建立與人相似癥狀的動物模型來進(jìn)行。常用的哮喘動物（大鼠、小鼠、豚鼠）模型都存在不足之處。如豚鼠致敏后的變態(tài)反應(yīng)與人類的不同，其更多由IgG介導(dǎo)；大鼠、小鼠制作的哮喘模型能產(chǎn)生特異性IgE，可臨床指征不明顯[1]。因此有必要尋找和開發(fā)新的哮喘動物模型。但哮喘新模型的開發(fā)還面臨一個具體問題，即除大鼠、小鼠、豚鼠外的其他實驗動物在卵清白蛋白（OVA）致敏后，因缺乏血清OVA特異性IgE的檢測試劑，使致敏效果難以判斷，這也阻礙了新模型的開發(fā)[2]。根據(jù)外周血嗜堿粒細(xì)胞（BASO）表面的IgE高親和力受體FcεRI的密度與血清IgE水平有較好的相關(guān)性[3]?？裳兄埔环NOVA熒光探針，用于對OVA致敏動物的外周血BASO細(xì)胞表面IgE高親和力受體FcεRI進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過其熒光示蹤可知該動物的致敏效果。量子點（quantum dots，QDs）熒光標(biāo)記技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一項新型熒光示蹤技術(shù)。本研究利用巰基丁二酸為表面修飾劑合成的水溶性CdTe/ZnSe核殼QDs與OVA偶聯(lián)，制備OVA-CdTe/ZnSe探針，用于對OVA致敏的小鼠外周血BASO細(xì)胞表面IgE高親和力受體FcεRI進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

巰基丁二酸（Mercaptosuccinic acid，MSA）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）和佐劑液態(tài)鋁（Sigma-Aldrich公司）；碲粉（Te）、硒粉（Se）、氯化鎘（CdCl2）、硼氫化鈉（NaBH4）、氧化鋅（ZnO）（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；C57BL/6小鼠（6~8周齡雄性，購自浙江大學(xué)實驗動物中心）；去離子超純水處理系統(tǒng)（Milli-Q，Millipore公司）；凝膠成像系統(tǒng)（購自Gene Genius）；紫外-可見分光光度計（UV-2550，Shimadzu公司）；熒光光譜儀（F-2500，Hitachi公司）；激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS-SP，Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 OVA-CdTe/ZnSe探針的制備MSA包覆的CdTe/ZnSe核殼QDs的制備方法見參考文獻(xiàn)[4-5]。將CdTe/ZnSe與OVA進(jìn)行共價連接，即首先用NHS將QDs表面配體的羧基活化，然后再與蛋白質(zhì)表面氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，即得CdTe/ZnSe與OVA的偶聯(lián)物。具體方法：在1 ml水（NaOH調(diào)pH=8）中，加入200 μl巰基丁二酸修飾的CdTe/ZnSe溶液（OD488值為0.25）和50 μl 0.2g/L NHS，室溫活化10 min后，再加入100 μl OVA （0.1 mg/ml），室溫條件下旋轉(zhuǎn)混勻30 min，然后將CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行離心純化即得OVA-CdTe/ZnSe探針，4℃保存?zhèn)溆茫褂脮r以水溶解。

1.2.2 OVA-CdTe/ZnSe探針的凝膠電泳和光譜檢測瓊脂糖凝膠電泳分析CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)前后的分子大小變化，其電泳條件：瓊脂糖凝膠濃度0.8%，電壓80 V，電泳時間15 min，采用凝膠成像系統(tǒng)成像分析。UV-2550紫外-可見分光光度計測量CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)前后的吸收光譜變化，以水（pH=8）作空白校正基線。F-2500熒光光譜儀測量CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)前后的熒光發(fā)射光譜的變化，激發(fā)波長為460 nm，以水調(diào)零。

1.2.3 OVA-CdTe/ZnSe探針標(biāo)記嗜堿粒細(xì)胞表面IgE高親和力受體FcεRI 分別于第0、14天對C57BL/6小鼠腹腔注射致敏液0.2 ml（0.08%的OVA 0.1 ml與等體積佐劑液態(tài)鋁混合）致敏；第15天眼球采血，Percoll密度梯度離心法分離外周血BASO細(xì)胞。將BASO細(xì)胞于含有0.3%Triton-100的PBS作用10 min，0.01 mol/L PBS洗3次；于含有10%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中封閉20 min。滴加OVA-CdTe/ZnSe探針（用含10%BSA的PBS稀釋，對照滴加BSA-CdTe/ZnSe和CdTe/ZnSe），置于濕盒中，37℃，30 min。先0.01 mol/L PBST洗3次，然后0.01 mol/L PBS洗3次；緩沖甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡下成像，激發(fā)波長為488 nm。

2 結(jié)果

2.1 CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)效果的鑒定

CdTe/ZnSe及其與OVA偶聯(lián)物的表面帶有大量的羧基負(fù)電荷，在電場中會向正極泳動。圖1為CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)物的電泳結(jié)果。如圖2所示，在400~700 nm范圍內(nèi)，CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)前后的吸收光譜隨波長變化不明顯，而偶聯(lián)后的熒光略有增強(qiáng)，且熒光峰位從628 nm紅移至635 nm。

2.2 OVA-CdTe/ZnSe探針熒光示蹤OVA特異性IgE-FcεRI復(fù)合物

在激光共聚焦顯微鏡視野下，能清晰觀測BASO表面IgE-FcεRI復(fù)合物被OVA-CdTe/ZnSe探針標(biāo)記后發(fā)出的紅色熒光（圖3-A），而BSA-CdTe/ZnSe和CdTe/ZnSe因不能與細(xì)胞膜結(jié)合而無明顯熒光（圖3-B、3-C）。

3 討論

QDs是一種由Ⅱ~Ⅵ族或Ⅲ~Ⅴ族元素組成的尺寸在1~100 nm之間穩(wěn)定的微小晶粒，受激后可以發(fā)射熒光[6]。QDs的激發(fā)波長范圍可以涵蓋整個光譜，用同一波長的光可以激發(fā)不同的QDs，同時獲得多種顏色熒光，方便用于多目標(biāo)分子的多色標(biāo)記，并且核殼結(jié)構(gòu)QDs的表面經(jīng)過修飾，其毒性要比有機(jī)熒光染料弱得多，很有希望成為新一代生物熒光標(biāo)記物[7]。本研究合成的CdTe/ZnSe核殼QDs不需經(jīng)過任何后續(xù)處理，熒光產(chǎn)率高達(dá)44%，并且ZnSe外殼及MSA的修飾大大提高了原始CdTe核的穩(wěn)定性和生物相容性[4-5]。將CdTe/ZnSe與OVA共價連接后，復(fù)合物粒徑和相對質(zhì)量增大，因此導(dǎo)致電泳遷移率降低。同時與CdTe/ZnSe的電泳條帶相比，CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)物的熒光條帶展寬，是由于QDs與蛋白的偶聯(lián)比不固定所致。CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)后會對CdTe/ZnSe的熒光性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，其原因可能由于蛋白質(zhì)對量子點的表面修飾，而且量子點經(jīng)NHS作用與蛋白質(zhì)經(jīng)過共價連接，一個蛋白可能結(jié)合多個量子點，拉近量子點之間距離，導(dǎo)致量子點之間的偶極相互作用增強(qiáng)，使其Stokes位移增大，熒光峰位紅移[8-9]。這些都表明CdTe/ZnSe與OVA偶聯(lián)成功，經(jīng)純化后即獲得OVA-CdTe/ZnSe探針。另外本研究采用Percoll密度梯度離心法分離OVA致敏小鼠的外周血BASO細(xì)胞，致敏小鼠所產(chǎn)生的OVA特異性IgE可與BASO細(xì)胞表面FcεRI結(jié)合，形成FcεRI-IgE復(fù)合物，而OVA又能與OVA特異性IgE結(jié)合，經(jīng)OVA-CdTe/ZnSe探針標(biāo)記后即可在BASO細(xì)胞表面形成了FcεRI-IgE-OVA-CdTe/ZnSe復(fù)合物，通過熒光成像可清晰顯示出BASO細(xì)胞表面FcεRI的密度。由于OVA-CdTe/ZnSe探針識別OVA特異性IgE介導(dǎo)連接FcεRI，因此應(yīng)用上不受物種限制，尤其在開發(fā)哮喘新動物模型的特異性IgE檢測方面具有很好的應(yīng)用價值。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2011-10-24）

[基金項目] 浙江省實驗動物科技計劃項目（編號：2009F80011）。