沈京群，劉殿閣，陳涵枝，丁弘，汪湜，周建東

(1．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150001;2．東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 南京 210009)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)慢性微血管病重要并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎衰的主要原因，病理特征為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在腎小球內(nèi)過(guò)度積聚，這主要是由于ECM自身代謝紊亂所致［1］。Ets-1作為原癌基因，具有多種生物學(xué)功能，與編碼蛋白酶的啟動(dòng)基因相互作用，增加基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2及尿纖溶酶原激活物(u-PA)基因啟動(dòng)活性，在諸多纖維化事件基質(zhì)重塑中起重要作用［2-4］。本研究通過(guò)免疫組化，觀察2型 DN腎組織內(nèi)Ets-1、MMP-2、TIMP-2、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)及IV型膠原(ColⅣ)的表達(dá)，并探討在2型DN基質(zhì)重塑中的作用。

1 資料與方法

1． 1 一般資料

研究對(duì)象來(lái)自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院2004年1月至2009年12月成人病例45例，均經(jīng)腎穿刺活檢組織病理及免疫熒光證實(shí)，大部分病例行電鏡檢查。DN組按美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)2007年版的糖尿病診療標(biāo)準(zhǔn)選自同期腎穿刺活檢證實(shí)DN 25例，其中男15例，女10例;年齡35～67歲，平均(41.72±7.02)歲。輕微病變性腎病(MCD)組按WHO(1982年及改良的1995年)腎小球疾病組織學(xué)分型方案選自同期腎穿刺活檢證實(shí)MCD 20例，其中男12例，女8例;年齡18～46歲，平均(38.65±7.78)歲。兩組在性別和年齡上無(wú)顯著差異。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)1型DM、心力衰竭、發(fā)熱、腫瘤、近期使用過(guò)影響腎功能的藥物及免疫抑制劑者;(2)近期有手術(shù)和創(chuàng)傷史以及自身免疫性疾病;(3)3個(gè)月內(nèi)患有心肌梗死、腦卒中、不穩(wěn)定心絞痛等嚴(yán)重心腦血管疾病;(4)懷孕或哺乳期婦女。

1． 2 方法

1．2.1 腎臟病理組織學(xué)檢查 腎組織石蠟切片(4 μm)，進(jìn)行 HE、PAS、PAM 和 Masson 染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1．2.2 免疫組化 采用SP法［5-6］。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，用10%山羊血清或10%兔血清封閉，分別滴加適當(dāng)稀釋的第一抗體，4℃過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，再加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記鏈霉素親合素，聯(lián)苯胺(DAB)顯色。第一抗體如下:Ets-1(美國(guó)Santa Cruz公司)，MMP-2和 TIMP-2(Chemicon公司)，α-SMA(Dako公司)，Vimentin抗體(Dako公司)，ColⅣ(Chemicon公司)。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件半定量分析，分別對(duì)腎小球及腎小管間質(zhì)各種抗原蛋白的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算染色陽(yáng)性部位(棕色染色區(qū)域)相對(duì)IOD(累積光密度)。

1．2.3 免疫組化雙重染色 堿性磷酸酶(AP)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)不同顯色完成［5-6］。切片用抗Ets-1或α-SMA單克隆抗體孵化，然后用生物素標(biāo)識(shí)的第二抗體和AP標(biāo)記的抗生物素卵白素分別孵化，用BCIP/NBT顯色，呈紫黑色。染有Ets-1或α-SMA的切片用HRP標(biāo)記的抗生物素卵白素進(jìn)行復(fù)染MMP-2或ColⅣ，用AEC/H2O2顯色，呈深紅色。

1． 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，用SPSS 13.0軟件處理，方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用t'檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2． 1 腎臟組織病理改變

MCD組僅見腎小球系膜區(qū)擴(kuò)展，未見基底膜增厚，腎小管及腎間質(zhì)大致正常。DN組可見腎小球內(nèi)滲出性病變、腎小球基底膜彌漫增厚及系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)彌漫性增生，可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹、間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化形成。

2． 2 免疫組化表達(dá)

兩組腎內(nèi) Ets-1、MMP-2、TIMP-2、α-SMA、Vimentin及ColⅣ免疫組化半定量分析結(jié)果見表1。

表1 Ets-1、MMP-2、TIMP-2、α-SM、vimentin及ColⅣ免疫組化半定量分析(xˉ±s)

MCD組腎內(nèi)Ets-1微量表達(dá)(圖1A)。與MCD組比較，DN組腎小球及腎小管間質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)Ets-1表達(dá)明顯增加(圖1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MCD組腎內(nèi)MMP-2弱陽(yáng)性表達(dá)(圖2A)。同MCD組比較，DN組腎內(nèi)可見MMP-2增加性表達(dá)(圖2B，P＜0.05)。與MCD組(圖3A)相比，DN組腎內(nèi)TIMP-2表達(dá)顯著性增加(圖3B，P＜0.05)。DN組腎小球及腎小管間質(zhì)內(nèi)MMP-2/TIMP-2比值顯著性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.57±0.31 vs 1.43±1.20，0.82±0.40 vs 1.64±1.55，均P＜0.05)。MCD組腎內(nèi)血管壁強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)外，腎小球及腎小管間質(zhì)輕微表達(dá)(圖4A)。與MCD組比較，DN組腎內(nèi)α-SMA表達(dá)顯著性增加(圖4B，P＜0.05)。MCD組Vimentin主要在腎小球內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)(圖5A)。同 MCD組相比，DN組Vimentin在腎小球表達(dá)明顯增加(圖5A，P＜0.05)，而Vimentin在腎小管間質(zhì)內(nèi)的表達(dá)顯著性增加(圖5A，P＜0.01)。MCD組ColⅣ在腎小球基底膜及腎小管基底膜均有明確表達(dá)(圖6A)。與MCD組比較，DN組ColⅣ在腎小球及腎小管間質(zhì)內(nèi)表達(dá)顯著性增加(圖6B，P ＜0.01)。

2． 3 免疫組化雙重染色

免疫雙染顯示，DN組大多數(shù)表型發(fā)生變化的α-SMA陽(yáng)性(黑色)腎小球系膜細(xì)胞、腎小管間質(zhì)細(xì)胞同時(shí)具有ColⅣ的陽(yáng)性表達(dá)(紅色)(圖7A)，在增生硬化的腎小球系膜細(xì)胞及病變的腎小管間質(zhì)處ColⅣ表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(紅色)內(nèi)亦有α-SMA陽(yáng)性表達(dá)(黑色)(圖7A)。增生硬化的腎小球及病變的腎小管間質(zhì)內(nèi)Ets-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(黑色)亦可見MMP-2陽(yáng)性表達(dá)(紅色)(圖7B)，在增生硬化的腎小球及病變的腎小管間質(zhì)區(qū)Ets-1細(xì)胞(黑色)具有MMP-2陽(yáng)性表達(dá)(紅色)(圖7B)。

圖1 Ets-1免疫組化表達(dá)(SP×200)

圖2 MMP-2免疫組化表達(dá)(SP×200)

圖3 TIMP-2免疫組化表達(dá)(SP×200)

圖4 α-SMA免疫組化表達(dá)(SP×200)

圖5 vimentin免疫組化表達(dá)(SP×200)

圖7 免疫組化雙重染色(×200)

3 討 論

DN是DM微血管病變的常見并發(fā)癥之一，也是2型DM患者的首位死因。DN腎組織早期病理改變?yōu)槟I小球肥大、ECM聚集、基底膜增厚，晚期出現(xiàn)彌漫性腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致腎功能衰竭［7］。因此探討DN的發(fā)病機(jī)制及尋找防治DN的有效方法，已成為當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)研究的重要課題。

Ets-1是轉(zhuǎn)錄因子ets家族成員之一，與v-est原癌基因高度同源性。Ets-1蛋白通過(guò)DNA連接區(qū)域結(jié)合中央GGA的核心序列 (PEA3)，在AP-1位點(diǎn)與CFos/c-Jun復(fù)合物相互作用，從而激活特定的啟動(dòng)因子表達(dá)［8］，包括 MMP-1、2、3、9，u-PA，TIMP-1 及 TIMP-2，表明Ets-1原癌基因在MMPs調(diào)控中起關(guān)鍵性作用。

MMPs是一組能特異地降解ECM成分的鋅(Zn2+)依賴的酶家族，由結(jié)締組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、腎小球固有細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等合成與分泌，并有特異性的天然抑制劑TIMPs抑制其活性［9］。MMPs能降解幾乎所有的ECM成分。MMP-2為明膠酶的一種，它主要定位于腎小球，是ColⅣ的主要降解酶。TIMPs是MMPs的特異性組織抑制物，與活化型MMPs高親和，以1∶1比例非共價(jià)鍵結(jié)合形成 MMP-TIMP復(fù)合體，從而阻斷MMPs與底物的結(jié)合和活化，對(duì)MMPs有不同程度的抑制作用，作為腎內(nèi)調(diào)節(jié)MMPs活性的主要物質(zhì)而參與ECM代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程［10］。生理狀態(tài)下，MMPs/TIMPs處于一種動(dòng)態(tài)平衡中，維持ECM正常代謝;在病理狀態(tài)時(shí)該平衡狀態(tài)被打破，造成ECM的代謝紊亂。TIMP-2是一種非糖化的由194個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其分子量為21 kD，可特異性抑制MMP-2的活性而導(dǎo)致ECM積聚［11］。

本研究表明，2型DN腎內(nèi)Ets-1原癌基因明顯增高，同時(shí)，MMP-2的表達(dá)亦增加。但是，TIMP-2表達(dá)增加更為明顯，引起MMP-2/TIMP-2比值顯著性下降，ECM降解少于合成，最終導(dǎo)致膠原過(guò)度沉積。因此，有理由推測(cè):Ets-1表達(dá)增高可能通過(guò)上調(diào)MMP-2的表達(dá)，進(jìn)而使ECM降解增加。但是，尚不足以克服因TIMP-2表達(dá)顯著上調(diào)而導(dǎo)致ECM合成大于降解，引起2型DN腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生。免疫雙染顯示，DN組腎小球固有細(xì)胞及腎小管間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ets-1增加性表達(dá)，往往同時(shí)伴有MMP-2陽(yáng)性表達(dá)，表明Ets-1可能是上調(diào)MMP-2表達(dá)的客觀形態(tài)學(xué)依據(jù)，進(jìn)一步證實(shí)了Ets-1與MMP-2/TIMP-2系統(tǒng)平衡的密切關(guān)系。免疫雙染表明多數(shù)α-SMA陽(yáng)性的腎小球固有細(xì)胞及腎小管間質(zhì)細(xì)胞同時(shí)具有ColⅣ陽(yáng)性表達(dá)，提示α-SMA陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞分泌膠原成分，導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積。

本研究首次探討了Ets-1在2型DN中的表達(dá)及基質(zhì)重塑過(guò)程的重要影響，但是有關(guān)Ets-1的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。研究已表明，DM發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中高血糖狀態(tài)往往伴隨復(fù)雜性炎癥反應(yīng)，同時(shí)DN時(shí)存在腎組織缺血、缺氧，后者又加重炎癥反應(yīng)，諸多炎癥介質(zhì)與Ets-1的表達(dá)有關(guān)。例如，AngⅡ參與的MAPK信號(hào)通路的ERK1/2、p38和JNK能將外部刺激傳到核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子包括Ets家族，引起下游基因表達(dá)的時(shí)空變化［12］，Ets-1在腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)中的表達(dá)上調(diào)可以有效阻止TGF-β誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原產(chǎn)生，并能拮抗TGF-β的表達(dá)，也提示Ets-1可能通過(guò)作用TGF-β受體在 TGF-β參與的 Smad及 RhoA Rhokinase、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用［13］。此外，低氧血癥、酸中毒及微環(huán)境營(yíng)養(yǎng)不良等誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌，均能上調(diào)Ets-1的活性。因此，有理由推測(cè)本研究中Ets-1表達(dá)上調(diào)可能與以上因素有一定關(guān)系?？傊珽ts-1轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2系統(tǒng)平衡而影響ECM代謝，在2型DN基質(zhì)重塑過(guò)程中起重要作用。

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