戚寧，杜明華，張東生，張佳，劉鳳

(1．東南大學醫(yī)學院，江蘇南京 210009;2．江蘇省中醫(yī)院核醫(yī)學科，江蘇南京 210029)

阿霉素(注射用鹽酸多柔比星，doxorubicin，DOX)是由鏈絲霉菌屬發(fā)酵液分離得到的抗有絲分裂和細胞毒性抗生素，也可由柔紅霉素來合成，其抗腫瘤譜廣，活性強，作用機制主要是阿霉素分子嵌入DNA抑制核酸的合成，對實體瘤如肝癌、乳腺癌、肺癌等具較好的療效，是腫瘤化療方面最重要的藥物之一。

白蛋白作為抗腫瘤藥物載體，是一種無毒、無抗原性、生物相容性好、易降解且性質(zhì)穩(wěn)定的微球材料，有實驗證實這種微球具有緩釋特性，并可以有效改變藥物的組織分布，延緩藥物釋放［1-2］。

腫瘤化療效果與藥物作用的部位和持續(xù)的時間有關(guān)，藥物到達血液系統(tǒng)時，傳統(tǒng)藥物劑型不能有效調(diào)整藥物在體內(nèi)的分布和清除，藥物在非靶位的積累將引起全身毒副作用，于是有學者開始研究制備可以特異殺傷腫瘤的具有靶向性的免疫納米粒［2-5］。本實驗以阿霉素為模型藥物，牛血清白蛋白為藥物載體制備白蛋白納米球，再與抗人肝癌甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體進行交聯(lián)制成免疫納米球，以提高藥物對腫瘤細胞的特異性選擇，降低藥物毒副作用，提高療效。有藥物和毒素等直接與單克隆抗體結(jié)合的研究報道［6］，但未見載阿霉素納米粒與抗人肝癌AFP單克隆抗體交聯(lián)的報道。

1 材料和方法

1． 1 藥品試劑

注射用鹽酸多柔比星(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)，牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)，氫氧化鈉(NaOH，0.01 mmol·L－1，自配);pH 試紙(上海三愛思試劑有限公司)，單克隆抗體AFP(鼠抗人，上海葉民生物科技有限公司)，異型蛋白質(zhì)功能交聯(lián)劑(SPDP，Sigma公司)，胰蛋白酶(美國Amresco公司)，二硫蘇糖醇(DTT，Sigma公司)，無水乙醇(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，透析袋，雙蒸水。

1． 2 儀器

85-2A數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，LGF-12冷凍干燥機(北京忪源華興科技發(fā)展有限公司)，搖床，離心機(美國)，電泳儀，紫外分光光度計，透射電鏡(JEM-2100HR，日本)。

1． 3DOX-BSA-NP 的制備、檢測

經(jīng)過預(yù)實驗和總結(jié)文獻資料，經(jīng)過優(yōu)化［2，5］，去溶劑化法制備工藝如下:精密稱取200 mg BSA與5 mg DOX溶液輕微振蕩混勻，磁力攪拌一定時間后，NaOH調(diào)節(jié)溶液使之pH為9，磁力攪拌下緩慢滴入無水乙醇約 25 ml，滴加速度約為 1 ml·1 min－1，攪拌適當時間后加入25%戊二醛溶液，繼續(xù)磁力攪拌，固化過夜，次日離心，棄去上清液，蒸餾水洗滌3次，用雙蒸水定容成懸液狀。－20℃冷凍后，真空低壓干燥，得凍干粉，裝入小瓶，存于冰箱冷凍層備用。

檢測:(1)確定DOX測定波長:適量濃度DOX用生理鹽水溶解，以生理鹽水為參比調(diào)零，紫外分光光度計波長掃描。(2)繪制標準曲線:精密稱取干燥至恒重的阿霉素標準品適量，用水溶解定容至50 ml，配成200 μg·ml－1的儲備液，分別吸取 0.50、0.80、1.10、1.40、1.70、2.00 ml于 10 ml的容量瓶中，定容配成標準液，以蒸餾水為空白，480 nm處測得吸光度A，以質(zhì)量濃度ρ對吸光度A線性回歸。(3)載藥量、包封率測定:精密稱取DOX-BSA-NP適量，加0.1%的胰蛋白酶的生理鹽水液，避光，37℃恒溫磁力攪拌至澄清，轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，定容、過濾，取濾液，在480 nm處測紫外吸光度，帶入標準曲線計算藥物含量。載藥量=納米粒中阿霉素的含量/納米粒的總質(zhì)量;包封率=納米粒中阿霉素的含量/阿霉素的投藥量。(4)體外釋藥特性觀測:精密稱取適量DOX-BSA-NP，生理鹽水溶解，超聲分散均勻，轉(zhuǎn)入預(yù)先處理過的透析袋內(nèi)，將透析袋懸至在盛有生理鹽水的大燒杯中，37℃恒溫振蕩，定時取樣3 ml，同時補加入同體積生理鹽水，測樣品480 nm處的吸光度A。由回歸直線方程計算不同時間點藥物質(zhì)量濃度，以各時間點為橫坐標，累積釋藥分數(shù)為縱坐標，繪出體外釋藥曲線。

1． 4 antiAFP-DOX-BSA-NP 的制備、鑒定

制備:參考文獻［6-7］方法，將活化的納米粒與單抗-PDP混合，4℃輕搖反應(yīng)約15 h。經(jīng)Hank's液洗滌4 次，15 000 r·min－1，45 s，得沉淀即為免疫毫微球。

鑒定:(1)聚丙烯酰胺凝膠電泳測定共價連接:取antiAFP-DOX-BSA-NP和抗體AFP與足量上樣緩沖液反應(yīng)后上樣。以antiAFP-DOX-BSA-NP與不加還原劑的上樣緩沖液做對照組，抗體AFP為空白組。80 V穩(wěn)壓，約30 min進入分離膠，調(diào)穩(wěn)壓至100 V，1 h后剝離膠板，于考馬斯亮藍染色液中染色1 h，再用脫色液脫至樣品帶清晰。(2)電鏡觀測粒徑大小及形態(tài):經(jīng)超聲均勻分散的微球懸液滴在銅網(wǎng)上，按倍數(shù)稀釋，空氣中干燥后，電鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2． 1 DOX吸收光譜測定

于300～800 nm掃描得阿霉素最高吸收峰在480 nm，見圖1。

圖1 阿霉素(50 μg·ml－1)吸收光譜圖Fig 1 The absorption spectrum image of doxorubicin(50 μg·ml－1)

阿霉素藥量質(zhì)量濃度對光吸光度A進行直線回歸，得標準曲線線性回歸方程為:Y=3 347．7X－54．644，相關(guān)系數(shù)r=0.994 2。計算DOX-BSA-NP的有效載藥量約為1.8%，包封率約為90.3%。見圖2。

圖2 阿霉素質(zhì)量濃度與吸光度A成明顯的線性比例關(guān)系Fig 2 The concentration of DOX is clearly linearly proportional to the absorbance

DOX-BSA-NP形態(tài)學性質(zhì)觀察:凍干粉劑外觀為紅色，再溶解性好。電鏡下觀察呈圓球狀，表面光滑，分散性好，粒徑均勻，粒徑范圍80～160 nm。見圖3～4。

圖3 DOX-BSA-NP外觀圖Fig 3 The outside view of the DOX-BSA-NP

圖4 DOX-BSA-NP的電鏡照片(×25 000)Fig 4 The TEM image of DOX-BSA-NP(amplification factor 25 000)

體外釋藥性質(zhì)檢測:DOX-BSA-NP釋藥呈持續(xù)緩慢狀態(tài)，至第7天累計釋藥分數(shù)達95%。透析袋對藥物的釋放也有一定的限速作用。見圖5。

圖5 DOX-BSA-NP體外釋放的累積釋放率-時間曲線Fig 5 The curve of the accumulation release rate in vitro-time of DOX-BSA-NP

2． 2 免疫毫微球的鑒定

還原電泳分析:加還原劑的一組antiAFP-DOXBSA-NP在遠端有兩條電泳條帶，與抗體加還原組的兩條條帶位置相同，推測為抗體被分解為輕重兩條鏈所形成的對應(yīng)的條帶。未加還原劑的antiAFP-DOXBSA-NP未見電泳條帶說明微球與其表面的抗體不是通過離子鍵連接。未還原的抗體在近端形成一條較粗的電泳條帶，符合AFP分子量大小所在位置。

免疫毫微球的電鏡觀測結(jié)果顯示，免疫毫微球呈直徑330～400 nm的圓球形，大小尚均勻，但分散性欠佳，有輕度的融合。

圖6 免疫毫微粒電鏡照片(×10 000)Fig 6The TEM image of antiAFP-DOX-BSA-NP(amplification factor 10 000)

3 討 論

化療藥物需達到一定濃度才能有效殺傷腫瘤細胞，起到化療作用，增大藥量可達此目的，但同時增大了藥物對正常組織的毒副作用。單抗特異性高，對腫瘤的親和力強，對正常細胞損傷也很小，有超過200種基于單抗或其片段的載藥系統(tǒng)處于臨床前期或臨床研究之中［5］，并已成為導向治療最常用的載體。阿霉素抗瘤譜廣，可用于多種實體瘤，但其心臟毒性作用限制了臨床應(yīng)用，因此有關(guān)阿霉素納米粒的研究備受關(guān)注。提高腫瘤納米靶向治療療效，降低用藥量，減少副作用，已成為藥物研制的熱點和前沿［8］。阿霉素納米微球是目前較有代表性的抗癌靶向制劑之一［9-11］。本實驗旨在制備阿霉素白蛋白納米粒，同時與甲胎蛋白單抗偶聯(lián)，制成免疫毫微粒，并初步觀測其形態(tài)、粒徑大小，以期用于臨床腫瘤治療。

載藥微球經(jīng)靜脈注射后，在體內(nèi)的分布首先取決于微粒的粒徑大小。通常粒徑在2.5～10 μm時，大部分積集于巨噬細胞。大于7 μm的微粒通常被肺的最小毛細血管床以機械濾過方式截留，被單核白細胞攝取進入肺組織或肺氣泡。小于7 μm時一般被肝、脾中的巨噬細胞攝取，200～400 nm的納米粒集中于肝后迅速被肝清除，小于10 nm的納米粒則緩慢積集于骨髓［1，3］。納米制劑制備的關(guān)鍵是控制粒子的大小以獲得均勻粒度分布［12］。實驗中發(fā)現(xiàn)，白蛋白濃度越低，成球率越低;無水乙醇滴加量過多，滴加速度過快，都容易產(chǎn)生沉淀，導致聚集失敗;攪拌速度過慢，滴加入的乙醇局部濃度過高，產(chǎn)生的微球粒徑大小易不均勻。另外，白蛋白溶液濃度、攪拌速度、溫度、交聯(lián)劑用量等都會影響藥物從微球中釋放的速度。

免疫毫微粒是以腫瘤特異性抗體為導向載體，將藥物吸附或包封在白蛋白等生物可降解材料中，經(jīng)固化分離而成的粒徑為納米級的膠態(tài)固體顆粒，載藥量較大，具有緩釋作用，通過抗體特異性的導向作用對腫瘤細胞選擇性結(jié)合殺傷［11］。免疫微球是抗體或抗原被包裹或吸附于聚合物微球上而具有免疫活性的，除作為抗癌藥的靶向治療，還可用來標記、分離細胞和疾病的診斷和治療［9-10，13］。

已有的蛋白質(zhì)連接方法包括戊二醛法、重氮化法、Mannich法等20余種［7］。用戊二醛交聯(lián)的缺點是醛基可產(chǎn)生抗體與抗體之間的聚合，降低抗體的活性，優(yōu)點是操作簡單［3，12］。本實驗所用的交聯(lián)劑SPDP是條件溫和、專一的異型雙功能交聯(lián)劑［14］，原理為:SPDP能分別與兩種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的伯氨基反應(yīng)，引入吡啶二硫基，用DTT將其中之一的吡啶二硫基還原成-SH，含有吡啶二硫基的蛋白于另一含-SH的蛋白發(fā)生巰基-吡啶二硫基交換，使兩種蛋白質(zhì)偶聯(lián)。本實驗結(jié)果表明，該方法可以成功制備單抗導向的免疫毫微粒，還原電泳分析證明了兩者之間的共價連接。實驗將進一步研究用放射性核素標記該免疫毫微粒，觀察和檢測其免疫特性及體內(nèi)外的抗肝癌效果。

［1］RAHIMNEJAD M，JAHANSHAHI M，NAJAFPOUR G D．Production of biological nanoparticles from bovine surum albumin for drug delivery［J］．Biotechnology，2006，5(20):1918-1923．

［2］FELIX K．Albumin as a drug carrier:design of prodrugs，drug conjugates and nanoparticles［J］．J Control Release，2008，132:171-183．

［3］JAMES D B，BETANCOURT T，BRANNON-PEPPAS L．Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics［J］．Adv Drug Deliv Rev，2008，60(15):1615-1626．

［4］LI F Q，SU H，WANG J，et al．Preparation and characterization of sodium ferulate entrapped bovine serum albumin nanoparticle for liver targeting［J］．Int J Pharm，2008，349(1-2):274-282．

［5］LI Q Y，LIU C，ZHANG X H，et al．Preparation，characterization and targeting of micronized 10-hydroxycamptothecin-loaded folate-conjugated human serum albumin nanoparticles to cancer cells［J］．Int J Nanomedicine，2011，6:397-405．

［6］DAN P，KARP J M，HONG S，et al．Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy［J］．Nat Nanotechnol，2007，2(12):751-760．

［7］CARLSSON J，DREVIN H，AXEN R．Protein thiolation and re-versible protein-protein conjugation［J］．Biochem J，1978，173(6):723-737．

［8］曲秋蓮，張英鴿．納米技術(shù)和材料在醫(yī)學上應(yīng)用的現(xiàn)狀與展望［J］．東南大學學報:醫(yī)學版，2011，30(1):157-163．

［9］HAUN J B，DEVARAJ N K，HILDERBRAND S A，et al．Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection［J］．Nat Nanotechnol，2010，5(9):660-665．

［10］SHI M，LU J，SHOICHET M S．Organic nanoscale drug carriers coupled with ligands for targeted drug delivery in cancer［J］．J Mater Chem，2009，19:5485-5498．

［11］ BRANNON-PEPPAS L，BLANCHETTE J O．Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy［J］．Adv Drug Deliv Rev，2004，56(11):1649-1659．

［12］王子妤，王麗，張東生．納米雄黃脂質(zhì)體的制備﹑特性檢測和體外抗腫瘤細胞作用的研究［J］．東南大學學報:醫(yī)學版，2009，28(3):175-179．

［13］SHI M，HO K，KEATING A，et al．Doxorubicin-conjugated immuno-nanoparticles for intracellular anticancer drug delivery［J］．Adv Funct Mater，2009，19:1689-1696．

［14］MAHMOUDIAN J，JEDDI-TEHRANI M，RABBANI H，et al．Conjugation of R-phycoerythrin to polyclonal antibody and F(ab')2 fragment of a polyclonal antibody by two different methods［J］．Avicenna J Med Biotechnol，2010，2(2):87-91．