王秀玲，葛武鵬，田毅，王遷，秦立虎，張旺倩

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西楊凌質(zhì)量技術(shù)檢測檢驗所，陜西 楊凌 712100；3.西安奶業(yè)科學(xué)研究所，西安 710065）

保加利亞乳桿菌在牛羊乳基質(zhì)中發(fā)酵性能差異的比較

王秀玲1，葛武鵬1，田毅1，王遷2，秦立虎3，張旺倩1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西楊凌質(zhì)量技術(shù)檢測檢驗所，陜西 楊凌 712100；3.西安奶業(yè)科學(xué)研究所，西安 710065）

探討了德氏保加利亞乳桿菌（L.Bulgaricus）在牛、羊乳基質(zhì)中的增菌規(guī)律及產(chǎn)酸、產(chǎn)香性能，并對其差異性進行了比較。結(jié)果表明：以羊乳為基質(zhì)42℃發(fā)酵8 h活菌數(shù)最高可達2.10×109mL-1，pH值降至4.16±0.07，滴定酸度（128.00±3.61）oT，丁二酮質(zhì)量濃度（11.72±0.25）mg/L，乙醛質(zhì)量濃度（6.09±0.22）mg/L；以牛乳為基質(zhì)相同條件發(fā)酵活菌數(shù)最高可達1.25×109mL-1，pH值降至4.45±0.08，滴定酸度（114.80±1.31）oT，丁二酮質(zhì)量濃度（11.56±0.11）mg/L，乙醛質(zhì)量濃度（5.12±0.38）mg/L。 結(jié)論：L.Bulgaricus以牛、羊乳為基質(zhì)42℃發(fā)酵8 h，其產(chǎn)丁二酮能力差異不顯著；而增菌效率、產(chǎn)酸及產(chǎn)乙醛能力差異極顯著，L.Bulgaricus在羊乳基質(zhì)中發(fā)酵性能優(yōu)于牛乳。

保加利亞乳桿菌；牛乳；羊乳；發(fā)酵性能

0 引 言

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）是常用的復(fù)合發(fā)酵劑菌株之一，具有多種促健康功效，是發(fā)酵食品的益生菌菌株之一[1]。在酸奶發(fā)酵過程中主要作用是產(chǎn)酸、產(chǎn)香，使酸奶具有特殊的風(fēng)味[2]。牛乳和羊乳都是乳酸菌生長的良好基質(zhì)，目前國內(nèi)外研究主要集中在不同乳酸菌以牛乳為基質(zhì)的發(fā)酵性能評價[3-5]及酸奶后熟期的酸度變化和香味物質(zhì)的含量變化等方面[6-7]。而對在羊乳基質(zhì)中產(chǎn)酸產(chǎn)香性能研究較少，尤其是同一菌株在不同乳基質(zhì)中發(fā)酵初始期的產(chǎn)酸產(chǎn)香性能差異性相關(guān)研究更鮮見報道。本實驗以德氏保加利亞乳桿菌為研究對象，以牛、羊乳為基質(zhì)，通過增菌效率、產(chǎn)酸、產(chǎn)香速率等方面進行發(fā)酵差異性評價，為制備乳基質(zhì)酸奶發(fā)酵劑以及優(yōu)質(zhì)酸奶制品提供參考。

1 實 驗

1.1 材料與設(shè)備

德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus,Lb.）；新鮮山羊乳；新鮮牛乳；脫脂乳粉。MRS培養(yǎng)基、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水、濃度為0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%三氯乙酸（TCA）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鄰苯二胺、濃度為4 mol/L的HCl溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%硫酸鐵銨、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%酚試劑、pH計校準(zhǔn)液等均自己配制。

SHP-250生化培養(yǎng)箱；PB-10pH計；SW-CJ-2D型凈化工作臺；BZG30菌落計數(shù)器；TOMY ES315自動蒸汽消毒柜；FA2004電子分析天平。紫外可見分光光度計（UV-1700，SHIMADZU）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備及處理

菌種純培養(yǎng)物—母發(fā)酵劑—生產(chǎn)發(fā)酵劑三代活化后，按接種量2%分別接于滅菌的牛、羊乳中，搖勻后分裝到預(yù)先滅好菌的三角瓶，42℃發(fā)酵。每隔1 h牛、羊乳各取出一樣品。直接進行梯度稀釋和酸度測定，取一定量剩余樣品與等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的TCA混勻，3 500 g離心15 min，過濾得上清液，用于測定丁二酮和乙醛。

1.2.2 pH值的測定

采用0.01級精密數(shù)顯酸度計測定。

1.2.3 滴定酸度oT的測定

根據(jù)GB5413.34-2010[8]，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定法測定。

1.2.4 活菌計數(shù)

按GB4789.35-2010[9]《食品微生物學(xué)檢驗—乳酸菌檢驗》部分檢測方法進行。

1.2.5 丁二酮的測定[10]

（1）丁二酮測定原理。鄰苯二胺可以與聯(lián)二酮類反應(yīng)生產(chǎn)2,3-二甲基并吡嗪，生成物的鹽酸鹽在335 nm波長下有吸收，可根據(jù)吸光值大小測得丁二酮質(zhì)量濃度。

（2）丁二酮質(zhì)量濃度的測定。每樣品取一定量與等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的TCA混勻，經(jīng)離心、過濾，得上清液，取出5 mL，分別加入0.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鄰苯二胺溶液，搖勻置于黑暗處放于30 min，然后加入1.0 mL濃度為4.0 mol/L的HCl溶液，終止反應(yīng)，混勻后在335 nm波長下用石英比色皿測定吸光值。每樣做3個平行取平均值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：鮮羊乳105℃（10 min）滅菌，用于準(zhǔn)確配制不同濃度的丁二酮標(biāo)準(zhǔn)液。然后各標(biāo)準(zhǔn)液按照樣品處理方法進行操作，測得各標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值，以丁二酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

1.2.6 乙醛的測定[11]

（1）測定原理。酚試劑分光光度法測定乙醛質(zhì)量濃度是根據(jù)乙醛與酚試劑[C6H4SN（CH3）C：NNH2·HCl,3-甲基-2-苯并噻唑腙,NBTH]反應(yīng)生成嗪類物質(zhì)，該物質(zhì)在酸性溶液中被高鐵離子氧化形成藍綠色化合物，根據(jù)顏色深淺比色定量。

（2）乙醛質(zhì)量濃度的測定。第1次反應(yīng)液制備：取5.0 mL樣品上清液（空白樣為5.0 mL 8%TCA）和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%酚試劑溶液用水定容至50 mL，靜止反應(yīng)30 min，得第1反應(yīng)液。第2次反應(yīng)液制備：取出5.0 mL第1次反應(yīng)液，加2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%酚試劑溶液，0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%硫酸鐵銨溶液，（43±1）℃條件反應(yīng)（第2次反應(yīng)）20 min，得第2次反應(yīng)液。流水冷卻，立即在630 nm處測定吸光度值，每樣品設(shè)定3個平行。

乙醛標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取1 mL乙醛（市售分析純，體積分?jǐn)?shù)為40%）用8%TCA溶液稀釋制備40 mg/L質(zhì)量濃度的乙醛母液。第1次反應(yīng)：取5.0 mL已知質(zhì)量濃度的乙醛母液溶液和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%酚試劑溶液，用蒸餾水定容至50 mL，靜止反應(yīng)30 min；第2次反應(yīng)：分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL的第1次反應(yīng)液，以水補足5.0 mL，隨后按上述實驗操作進行，然后630 nm處測定吸光值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 Lb.在牛、羊乳基質(zhì)中的增菌規(guī)律比較

Lb.在牛、羊乳中的增菌規(guī)律如圖3所示。圖3中，二者變化趨勢基本一致，隨著發(fā)酵時間延長活菌數(shù)均呈增加趨勢，發(fā)酵3 h后羊乳中的活菌數(shù)明顯高于牛乳（P＜0.01），6～8 h后活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，在7 h時活菌數(shù)達到最大值，羊乳中活菌數(shù)可達2.10×109mL-1，而牛乳中活菌數(shù)為1.25×109mL-1，這說明羊乳比牛乳更能促進Lb.的生長，原因可能是羊乳中含有更多促Lb.增菌的生長因子，Laura Sanz Ceballos[12]和葛武鵬[13]研究表明羊乳中除丙氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸外其余各種氨基酸含量均比牛乳高，且8種必需氨基酸比例合適，接近FAO/WHO推薦的理想模式。這可能是促進Lb.在乳基質(zhì)中生長的因素之一，此外也有研究表明羊乳中的礦物質(zhì)含量高于牛乳，同時含有更利于益生菌生長的N源和C源[13]等都可能是潛在的促生長因素，諸方面因素使得羊乳更適合于Lb.的生長繁殖。但具體促生長原因尚不明確，有待于進行深入研究。

2.2 Lb.在牛、羊乳基質(zhì)中產(chǎn)酸性能的比較

鮮牛、羊乳滅菌后，按2%接種量分別進行接菌，搖勻分裝到已滅菌的三角瓶中，42℃發(fā)酵，每隔1 h各取出一樣品，測定其pH值和滴定酸度。所得結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，在同樣發(fā)酵條件（接種水平、溫度、時間）下，牛、羊乳發(fā)酵乳的pH值和滴定酸度變化趨勢基本一致，但羊乳發(fā)酵乳pH值降低速度比牛乳快，在發(fā)酵前2 h二者pH值之間差異不顯著（P＞0.05），而在發(fā)酵3 h后差異極顯著（P＜0.01），同時滴定酸度在發(fā)酵2 h以后差異也極顯著（P＜0.01），最終羊乳pH值降至4.16±0.07，滴定酸度達（128.00±3.61）oT；牛乳pH降至4.45±0.08，滴定酸度達（114.80±1.31）oT。 表明Lb.在羊乳中的產(chǎn)酸速度比在牛乳中更快。

2.3 Lb.在牛、羊乳基質(zhì)中產(chǎn)香性能的比較

2.3.1 發(fā)酵過程中丁二酮質(zhì)量濃度變化及差異性比較

丁二酮是酸奶主要風(fēng)味物質(zhì)之一，在發(fā)酵過程中牛、羊乳發(fā)酵乳丁二酮質(zhì)量濃度變化如圖5所示。由圖5可以看出，發(fā)酵前6 h牛乳發(fā)酵乳中丁二酮含量較羊乳發(fā)酵乳高，尤其在發(fā)酵5 h牛乳中丁二酮含量明顯高于羊乳，二者差異極顯著（P＜0.01），Lb.在羊乳中產(chǎn)丁二酮的能力滯后于牛乳，但發(fā)酵6 h后二者差異不顯著（P＞0.05），羊乳中丁二酮質(zhì)量濃度達（11.72±0.25）mg/L，牛乳中丁二酮質(zhì)量濃度達（11.56±0.11）mg/L。因此，Lb.在牛、羊乳基質(zhì)中產(chǎn)丁二酮能力接近。

2.3.2 發(fā)酵過程中乙醛質(zhì)量濃度變化及差異性比較

乙醛也是酸奶主要風(fēng)味物質(zhì)之一，在酸奶的發(fā)酵過程中主要由Lb.產(chǎn)生，以不同乳基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生乙醛的能力不同，圖6表明發(fā)酵前期（即4 h以內(nèi)）牛、羊乳發(fā)酵乳中乙醛質(zhì)量濃度差異不顯著（P＞0.05），而4～8 h差異極顯著（P＜0.01），經(jīng)8h發(fā)酵羊乳中乙醛質(zhì)量濃度明顯高于牛乳，最高可達（6.09±0.22）mg/L，而牛乳中僅為（5.12±0.38）mg/L。 在發(fā)酵3～4 h之間羊乳發(fā)酵乳中乙醛的質(zhì)量濃度增加最快，而在4～8 h之間變化不明顯，王紅葉[14]研究表明pH值降至5.0時開始產(chǎn)生乙醛，在pH值為5.5～4.5之間乙醛產(chǎn)生速度加快。本研究中乙醛質(zhì)量濃度的變化趨勢與之相符。Lb.在羊乳中產(chǎn)生乙醛的能力遠高于牛乳，原因可能是羊乳中蘇氨酸質(zhì)量濃度高于牛乳[13]，并且孟祥晨[15]和邢慧敏[6]報道乳酸菌產(chǎn)乙醛能力與菌體內(nèi)蘇氨酸醛縮酶有關(guān)，在蘇氨酸醛縮酶的作用下，蘇氨酸可轉(zhuǎn)變成甘氨酸和乙醛，這恰能解釋羊乳發(fā)酵乳乙醛質(zhì)量濃度高于牛乳發(fā)酵乳的原因。另一方面也可能是羊乳中促生長因子使Lb.繁殖快，從而產(chǎn)乙醛能力強。因此，羊乳比牛乳更合適Lb.產(chǎn)生乙醛，更適合生產(chǎn)具有特殊風(fēng)味的發(fā)酵乳制品。

3 結(jié) 論

（1）以羊乳為基質(zhì)42℃發(fā)酵8 h活菌數(shù)最高可達2.10×109mL-1，pH值 降 至4.16±0.07， 滴 定 酸 度（128.00±3.61）oT，丁二酮質(zhì)量濃度（11.72±0.25）mg/L，乙醛質(zhì)量濃度（6.09±0.22）mg/L。

（2）相同條件下以牛乳為基質(zhì)活菌數(shù)最高可達1.25×109mL-1，pH值 降 至4.45±0.08， 滴 定 酸 度（114.80±1.31）oT，丁二酮質(zhì)量濃度（11.56±0.11）mg/L，乙醛質(zhì)量濃度（5.12±0.38）mg/L。

（3）Lb.以羊乳為基質(zhì)42℃發(fā)酵，其增菌效率、產(chǎn)酸及產(chǎn)乙醛能力均優(yōu)于牛乳基質(zhì)，差異極顯著 （P＜0.01），而產(chǎn)丁二酮能力二者之間差異不顯著 （P＞0.05）。

（4）相同條件下，Lb.在羊乳中表現(xiàn)出更好的發(fā)酵性能。

[1]張和平,張列兵.現(xiàn)代乳品工業(yè)手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,2005.

[2]BESHKOVA D,SIMOVA E,FRENGOVA G,et al.Production of Flavor Compounds by Yogurt Starter Cultures[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，1998（20）：180-186.

[3]PINHEIRO de SOUZA OLIVEIRA R,Casazza A A,Aliakbarian B,et al.Co-metabolism in Skimmed Milk of Streptococcus Thermophilus in Co-cultures with Lactobacillus Bulgaricus or Lactobacillus Acidophilus[J].Journal of Biotechnology，2010,15：576-587.

[4]BOTTAZZI V,DELLAGLI F.Acetaldehyde and Diacetyl Production by Streptococcus Thermophilus and Other Lactic Streptococ[J].Dairy Res.，2010,34：109-113.

[5]甘伯中,杜寧娟,李帆，等.南牧區(qū)酸奶中乳酸菌的分離與發(fā)酵性能研究[J].食品科學(xué)，2009,30（3）：204-208.

[6]邢慧敏.少數(shù)民族自然發(fā)酵乳制品中乙醛高產(chǎn)乳酸菌的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[7]李妍,邢慧敏,邵亞東，等.發(fā)酵乳中丁二酮和乙醛含量檢測方法探討[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008,34（3）：157-159.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5413.34—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[9]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.35—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[10]于田利,褚慶環(huán),張佳程，等.丁二酮乳鏈球菌產(chǎn)生丁二酮含量的特性研究[J].中國釀造，2010,（10）：17-21.

[11]王偉君,張?zhí)m威,李延華，等.酚試劑分光光度法測定發(fā)酵乳中乙醛含量的研究[J].食品工業(yè)科技，2006,27（07）：179-182.

[12]LAURA S C,EVA R M.Composition of Goat and Cow Milk Produced Under Similar Conditions and Analyzed by Identical Methodology[J].Journal of Food Composition and Analysis,2009,22（4）：322-329.

[13]葛武鵬.山羊乳營養(yǎng)特性及對嗜酸乳桿菌增菌發(fā)酵效能的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[14]王紅葉,李麗華,陸淳等.乙醛、丁二酮對發(fā)酵乳風(fēng)味的影響[J].中國乳品工業(yè)，2010,38（10）：32-34.

[15]孟祥晨,杜鵬,李艾黎，等.乳酸菌與乳品發(fā)酵劑[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

Comparison of the fermentation properties differences of L.Bulgaricus in cow’s&goat’s milk

WANG Xiu-ling1,GE Wu-peng1,TIAN Yi1,WANG Qian2,QIN Li-hu3,ZHANG Wang-qian1
（1.College of Food Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Institution of inspection of Yangling bureau of quality and supervision，Yangling 712100,China;3.Xi'an Institute of Dairy&Technology,Xi'an 710065,China）

Aim to probe the fermentation properties differences of L.Bulgaricus in cow’s&goat’s milk,and explore the proliferation regulations of L.Bulgaricus in the two substrates,and their differences in a comparative study.The results showed that after 8h fermented in goat’s milk,the total colony form units reached 2.1×109mL-1;pH 4.16±0.07,titratable acidity 128.00±3.61oT,the yield of diacetyls reached（11.72±0.25）mg/L,and yield of acetaldehydes was（6.09±0.22）mg/L.While in the same conditions in cow’s milk the total colony form units reached 1.25×109mL-1;pH 4.45±0.08,titratable acidity（114.80±1.31）oT;the yield of diacetyls was（11.56±0.11）mg/L,and the yield of acetaldehydes was（5.12±0.38）mg/L.The results indicated that：there were no signifcant differences between the capacity of producing diacetyls of L.Bulgaricus in cow’s and goat’s milk,while the proliferation regulations,acid yield and the yield of acetaldehydes properties of goat’s milk were superior to cow’s milk.

Lactobacillus bulgaricus;cow’s milk;goat’s milk;fermentation

Q935

A

1001-2230（2012）09-0015-04

2012-03-27

西北農(nóng)林科技大學(xué)人才基金資助項目（22050205）。

王秀玲（1986-），女，碩士研究生，研究方向為功能性乳制品。

葛武鵬

book=18,ebook=273