肖陽，李慶章，張莉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

奶牛不同發(fā)育時(shí)期乳腺細(xì)胞凋亡規(guī)律的研究

肖陽，李慶章，張莉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

為系統(tǒng)地研究奶牛乳腺不同發(fā)育時(shí)期細(xì)胞凋亡的規(guī)律，應(yīng)用TUNEL法對奶牛不同發(fā)育時(shí)期正常乳腺組織（冰凍切片）的乳腺細(xì)胞凋亡進(jìn)行了系統(tǒng)檢測。結(jié)果表明，青春期乳腺發(fā)育緩慢，結(jié)構(gòu)變化較小，乳腺細(xì)胞凋亡量相對較少；妊娠期乳腺導(dǎo)管持續(xù)發(fā)育，凋亡量上升，其中妊娠初期2月，乳腺腺泡大量出現(xiàn)，脂肪細(xì)胞凋亡隨之增加，出現(xiàn)了一個(gè)高峰；泌乳期乳腺的結(jié)構(gòu)和功能最為完善，乳腺結(jié)構(gòu)變化很小，細(xì)胞凋亡量維持在很低水平；退化期腺泡瓦解，大量細(xì)胞發(fā)生凋亡，其中退化初期乳腺細(xì)胞凋亡持續(xù)增加，退化3 d達(dá)到最大值，之后凋亡量逐漸降低，退化30 d后乳腺已經(jīng)基本恢復(fù)到青春期狀態(tài)，凋亡細(xì)胞量也隨之減少。

奶牛；乳腺；冰凍切片；細(xì)胞凋亡；TUENL

0 引 言

細(xì)胞凋亡是1972年由英國阿伯丁大學(xué)病理學(xué)教授Kerr等[1]首先提出的。乳腺上皮細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在退化期[2-3]，是乳腺的一種自我修復(fù)機(jī)制[4]。退化的機(jī)制包括局部乳成分的化學(xué)反饋、儲(chǔ)存乳成分的形成、產(chǎn)奶停滯和乳房膨脹，以及細(xì)胞伸張導(dǎo)致乳分泌活力的損耗[5,6]。在組織水平，乳腺退化過程涉及白細(xì)胞吞噬、持續(xù)的上皮細(xì)胞死亡，或結(jié)締組織的增殖[7-9]。乳腺上皮細(xì)胞的凋亡對乳腺的發(fā)育和功能有重要作用[10]，是乳腺實(shí)現(xiàn)其功能的必經(jīng)階段。因此，系統(tǒng)地研究乳腺發(fā)育過程中乳腺上皮細(xì)胞凋亡的周期性規(guī)律，可以更好地了解乳腺發(fā)育結(jié)構(gòu)變化與泌乳功能的關(guān)系，有利于找到可以適當(dāng)延長泌乳期、提高產(chǎn)奶量的生物調(diào)控方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 動(dòng)物及取材

本研究選用36頭經(jīng)檢測無乳腺炎及其他疾病的健康荷斯坦奶牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

奶牛飼養(yǎng)到預(yù)訂取樣時(shí)間，乳房中部消毒，按常規(guī)手術(shù)切取少量乳腺組織塊，獲取組織樣本，20 min內(nèi)液氮凍存，實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采樣12個(gè)時(shí)間點(diǎn)：青春期（12月、14月），妊娠期（2月、4月、6月），圍產(chǎn)前期（分娩前7日），泌乳期（7日、50日、140日、280日），干乳期（3日、30日）。 每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)選取3頭奶牛做平行實(shí)驗(yàn)。每次試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2 試劑

DeadEndTMFluorometric TUNEL System（Pro-mega No.G3250），DNaseⅠ （TaKaRa No.D2210），DAPI（Sigma），其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 冰凍切片

冰凍切片機(jī)使用前將溫度調(diào)至-25℃預(yù)冷30 min，從液氮中取出待切片乳腺組織，自然解凍后用包埋劑將其固定在托架上，置于速冷臺(tái)上冷凍。待乳腺組織冷凍好以后，調(diào)整刀片和組織塊之間的位置，連續(xù)切片。將切片貼于包被好的載玻片上，每張切片厚度8 μm。

1.3.2 TUNEL檢測

切片置4%多聚甲醛20 min，PBS緩沖液 （pH值為7.4）洗2次，每次5 min。TdT酶處理切片10 min，TUNEL反應(yīng)混合液37℃孵育切片60 min（潮濕環(huán)境），切片置于2×SSC終止液中室溫終止15 min，PBS緩沖液（pH值為7.4）漂洗切片3次，每次5 min。切片進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染，DAPI染色10 min，去離子水洗滌切片3次，每次5 min。抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察，在同一視野分別拍攝熒光素標(biāo)記的綠色陽性信號(hào)和DAPI標(biāo)記的藍(lán)色核。

陽性對照采用了DNaseⅠ強(qiáng)制使組織切片中DNA斷裂，陰性對照移除TdT酶，用去離子水代替。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用軟件Image Pro Plus 5.0制作合成圖片，乳腺細(xì)胞凋亡的熒光強(qiáng)度用Image Pro 5.0 Plus軟件進(jìn)行分析，平均光密度值=光密度值/面積。所得數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)之間應(yīng)用SPSS（SPSS.16.0）統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 組織切片TUNEL結(jié)果

不同發(fā)育時(shí)期奶牛乳腺進(jìn)行冰凍切片，每個(gè)時(shí)期取3頭牛的乳腺進(jìn)行切片，每塊組織取連續(xù)3張切片，1張用于TUNEL法檢測陰性對照，1張用于TUNEL法檢測陽性對照，1張作正常TUNEL法檢測，熒光顯微鏡觀察，放大200倍（標(biāo)尺為100um）。圖片由Image-pro plus 5.0軟件合成。各時(shí)期結(jié)果如圖1所示，陽性結(jié)果如圖2所示。

藍(lán)色熒光代表DAPI染色細(xì)胞核，綠色熒光代表熒光素標(biāo)記的綠色信號(hào)

由圖1可以看出，青春期12個(gè)月，開始形成腺泡芽，導(dǎo)管系統(tǒng)迅速增長膨脹。一些大導(dǎo)管已經(jīng)有了導(dǎo)管腔，乳腺主要由脂肪組織組成。由圖A-a可以看出青春期12個(gè)月基本檢測不到細(xì)胞凋亡的陽性信號(hào)。青春期14個(gè)月，可以看出導(dǎo)管系統(tǒng)不斷發(fā)育，分支增多。圖片上可以看到較多的有導(dǎo)管腔的大導(dǎo)管。管腔增大，占據(jù)脂肪細(xì)胞位置。由圖A-b可以看出青春期14個(gè)月基本檢測不到細(xì)胞凋亡的陽性信號(hào)。

妊娠期2個(gè)月，乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)和腺泡迅速生長發(fā)育，導(dǎo)管分支大量增殖。腺泡芽大量形成，上皮細(xì)胞快速增殖和分化，小葉內(nèi)和小葉間的脂肪組織均明顯減少。奶牛乳腺中的脂肪組織逐漸被導(dǎo)管等實(shí)體組織所代替，實(shí)體組織已經(jīng)成為乳腺的主要組成部分。如圖B-a白色箭頭可見，妊娠初期2個(gè)月，綠色熒光信號(hào)很多，表明凋亡細(xì)胞的數(shù)量很多。妊娠4個(gè)月，奶牛乳腺組織中導(dǎo)管系統(tǒng)占據(jù)了大部分的乳腺位置，同時(shí)有少量腺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。乳腺上皮細(xì)胞繼續(xù)以較快的速度增長，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，腺泡腔逐步擴(kuò)大。牛妊娠4～5個(gè)月時(shí)，小葉已經(jīng)很明顯，終末乳導(dǎo)管開始出現(xiàn)，腺泡腔未完全形成。由圖B-b可以看出，妊娠4個(gè)月乳腺組織中有一定量的熒光信號(hào)，主要在乳腺脂肪墊中，少量存在于腺泡上皮細(xì)胞中。妊娠6個(gè)月乳腺已經(jīng)完全發(fā)育，腺泡腔大量出現(xiàn)，腺泡和導(dǎo)管的體積不斷增大。大量的小葉腺泡發(fā)育完全，腺泡分泌活動(dòng)進(jìn)一步增強(qiáng)，腺泡腔內(nèi)含有大量分泌物，腺泡也因此而擴(kuò)張。由圖B-c可以看出妊娠期6個(gè)月基本檢測不到細(xì)胞凋亡的陽性信號(hào)。奶牛乳腺妊娠7～9個(gè)月時(shí)，即產(chǎn)前時(shí)期，腺泡進(jìn)一步增大，腺上皮細(xì)胞開始具備分泌功能。同時(shí)，在組織結(jié)構(gòu)上接近于泌乳的乳房。約在分娩前2日，腺泡分泌初乳。由圖B-d可以看出，圍產(chǎn)期乳腺組織中出現(xiàn)一定量的熒光信號(hào)，主要在乳腺脂肪墊中，少量存在于腺泡上皮細(xì)胞中。

泌乳期乳腺中幾乎沒有脂肪細(xì)胞。隨著乳汁的產(chǎn)生和泌乳的開始，泌乳7 d和50 d，乳腺的腺泡開始增大、增多。由圖C-a和圖C-b可以看出，泌乳7 d和50 d乳腺組織中基本看不到凋亡信號(hào)。泌乳140 d，乳腺的結(jié)構(gòu)和功能都更加完善，是乳腺功能的高峰時(shí)期。由圖C-c可以看出，泌乳140 d乳腺組織中基本看不到凋亡信號(hào)。泌乳280 d，乳腺的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，有少量腺泡結(jié)構(gòu)破損，泌乳功能降低。由C-d圖可以看出，泌乳280 d乳腺組織中可以檢測到極少量的凋亡信號(hào)，主要分布在乳腺腺泡上皮細(xì)胞。

退化3 d，隨著泌乳的結(jié)束，乳腺進(jìn)入退化過程，腺泡結(jié)構(gòu)繼續(xù)解體，導(dǎo)管和腺泡上皮細(xì)胞開始發(fā)生凋亡。由圖D-a可以看出，退化3 d導(dǎo)管和腺泡中開始出現(xiàn)較多的凋亡熒光信號(hào)。大部分乳腺細(xì)胞進(jìn)入凋亡過程。主要分布在導(dǎo)管和破損的乳腺腺泡上皮細(xì)胞中。退化30 d，乳腺繼續(xù)退化，導(dǎo)管和腺泡繼續(xù)萎縮，實(shí)體組織之間出現(xiàn)脂肪細(xì)胞，大量的脂肪細(xì)胞圍繞在實(shí)體組織周圍，乳腺基本恢復(fù)至青春晚期的形態(tài)。由圖D-b可以看出，退化30 d乳腺中已經(jīng)基本看不到凋亡信號(hào)。

陽性對照，從圖中可以看出，由于先用DNaseⅠ人工切斷組織DNA，使得所有細(xì)胞基本都標(biāo)記了很強(qiáng)的綠色熒光。

2.2 乳腺細(xì)胞凋亡變化統(tǒng)計(jì)

每張切片進(jìn)行熒光顯微鏡觀察時(shí)隨機(jī)取5個(gè)視野拍攝熒光圖片，所得結(jié)果用Image Pro 5.0 Plus軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，各時(shí)期奶牛乳腺組織的凋亡程度用各時(shí)期的平均熒光強(qiáng)度±標(biāo)準(zhǔn)差表示（表1），統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

表1 奶牛乳腺細(xì)胞凋亡TUNEL法檢測結(jié)果

根據(jù)所得的數(shù)據(jù)結(jié)果，各個(gè)時(shí)期奶牛乳腺細(xì)胞凋亡的變化趨勢如圖3所示。

從圖3可以看出，青春期乳腺發(fā)育緩慢，乳腺細(xì)胞凋亡不明顯。妊娠初期，乳腺細(xì)胞以指數(shù)速率增殖，出現(xiàn)大量導(dǎo)管分支和導(dǎo)管腔，細(xì)胞損耗增多，因此細(xì)胞凋亡明顯上升。進(jìn)入泌乳期，乳腺結(jié)構(gòu)一直穩(wěn)定，維持功能性腺泡狀態(tài)，因此整個(gè)泌乳期，細(xì)胞凋亡不明顯。進(jìn)入退化期，乳腺上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加，在退化3 d達(dá)到高峰，隨后下降，在退化30 d，乳腺結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)到妊娠初期水平，乳腺組織中也基本檢測不到凋亡細(xì)胞的存在。

3 討 論

奶牛乳腺組織發(fā)育各階段結(jié)構(gòu)和功能都有特定的變化，與此相適應(yīng)的細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果呈現(xiàn)規(guī)律性變化。Holst等人報(bào)道過奶牛乳腺組織退化期的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)。指出腺泡上皮細(xì)胞是泌乳期很明顯的特征，退化期2天，腺泡上皮細(xì)胞含有大的液泡，此現(xiàn)象持續(xù)到第3周都能觀察到，但是此時(shí)高爾基體不明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體在整個(gè)研究時(shí)期都能觀察到。退化期過程中，小泡間空間遞增，同時(shí)腺泡腔空間減少。超微結(jié)構(gòu)檢測表明在退化期21 d和30 d的腺泡上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出功能性活躍但是泌乳量不活躍的現(xiàn)象[11]。在本研究中，雖然不是從超微結(jié)構(gòu)來探討奶牛乳腺組織中的細(xì)胞器變化，但是在組織學(xué)水平上得到了類似的結(jié)果。

剛進(jìn)入青春期的動(dòng)物，乳腺發(fā)育平穩(wěn)，乳腺組織大部分為脂肪墊結(jié)構(gòu)，處于等速生長（isometric growth）。實(shí)質(zhì)幾乎不發(fā)育，導(dǎo)管很小不發(fā)達(dá)，，此階段的TUNEL法檢測結(jié)果也顯示出非常少的陽性信號(hào)。隨著體內(nèi)激素水平的增高，導(dǎo)管系統(tǒng)開始生長，侵入脂肪墊，此時(shí)開始異速生長（allometric growth）[12]。妊娠期乳腺發(fā)育迅速，導(dǎo)管系統(tǒng)和腺泡迅速生長發(fā)育，在雌激素和孕酮的協(xié)同作用下，乳腺導(dǎo)管開始分支，脂肪墊上分布著許多大小不一、形態(tài)各異的腺泡，乳腺細(xì)胞逐漸以指數(shù)速率增殖[13]。妊娠2個(gè)月時(shí)，在垂體、卵巢和胎盤分泌的多種激素的共同作用下，導(dǎo)管系統(tǒng)和腺泡迅速生長發(fā)育，上皮細(xì)胞快速增殖和分化，導(dǎo)致細(xì)胞損耗很多，因此，TUNEL法檢測陽性信號(hào)很多。圍產(chǎn)期，腺泡分泌活動(dòng)進(jìn)一步增強(qiáng)，細(xì)胞損耗增多，腺泡腔也因此擴(kuò)張很大，因此TUNEL法檢測陽性信號(hào)也有了一個(gè)小高峰。泌乳期腺泡的結(jié)構(gòu)與妊娠后期基本相同，但乳腺發(fā)育并未終止[14]。乳腺實(shí)質(zhì)和乳腺上皮細(xì)胞一直持續(xù)增殖，泌乳期乳腺小葉內(nèi)充滿大的腺泡，乳房明顯增大，直到泌乳起始乳腺才成為分化和發(fā)育完全的成體器官，所以泌乳期乳腺細(xì)胞的數(shù)目是決定乳產(chǎn)量的至關(guān)重要的因素[15]。這一時(shí)期，乳腺結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，幾乎沒有新生和退化的結(jié)構(gòu)變化，因此凋亡信號(hào)不明顯。泌乳晚期直至退化之前，乳腺腺泡結(jié)構(gòu)開始打開，逐漸向退化期過渡，腺泡上皮細(xì)胞逐漸開始發(fā)生凋亡，此時(shí)凋亡信號(hào)要比泌乳初期的多。乳腺退化期是動(dòng)物哺乳周期一個(gè)重要的乳腺修復(fù)過程。在本研究中，TUNEL法檢測結(jié)果表明，退化3 d時(shí)乳腺上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量達(dá)到峰值，綠色陽性信號(hào)幾乎滿屏，隨后下降，恢復(fù)到青春期狀態(tài)，開始下一輪往復(fù)循環(huán)。

綜上所述，在整個(gè)乳腺發(fā)育、泌乳和退化的過程中，伴隨著乳腺結(jié)構(gòu)的變化，乳腺組織共經(jīng)歷3個(gè)比較明顯的凋亡過程。第一個(gè)凋亡高峰在妊娠期2個(gè)月，導(dǎo)管腔增大，乳腺組織中脂肪細(xì)胞和導(dǎo)管周圍的結(jié)締組織細(xì)胞凋亡顯著。圍產(chǎn)期產(chǎn)前7天，這一階段導(dǎo)管分支增多伴隨著乳腺脂肪墊的脂肪細(xì)胞消失，乳腺組織中凋亡信號(hào)達(dá)到第二個(gè)小高峰。進(jìn)入泌乳期，乳腺結(jié)構(gòu)一直穩(wěn)定維持功能性腺泡狀態(tài)，細(xì)胞凋亡不明顯，直到泌乳晚期至退化期，乳腺退化啟動(dòng)，從泌乳280 d開始，乳腺上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目開始增加，到退化3 d達(dá)到高峰，這是乳腺組織在發(fā)育循環(huán)中的第三個(gè)細(xì)胞凋亡高峰。隨后下降，在退化30 d基本恢復(fù)到青春初期水平，至此乳腺組織完成泌乳后的重建，結(jié)構(gòu)也恢復(fù)到青春期性成熟時(shí)的狀態(tài)。

[1]KERR J F,WYLLIE A H,CURRIE A R.Apoptosis：a Basic Biological Phenomenon with Wide-Ranging Implications in Tissue Kinetics[J].British Journal of Cancer，1972.26（4）：239-257.

[2]HURLEY WL.Mammary Function During the Nonlactating Period：Enzyme,Lactose,Protein Concentrations,and pH of Mammary Secretions[J].J Dairy Sci,1987.70：20–28.

[3]HOLST BD,HURLEY WL,NELSON DR.Involution of the Bovine Mammary Gland：Histological and Ultrastructural Changes[J].J Dairy Sci,1987.70：935–944.

[4]GREEN KA,STREULI CH.Apoptosis Regulation in the Mammary Gland[J].Cell Mol Life Sci,2004.61（15）：1867-1883.

[5]HURLEY WL.Mammary Gland Function During Involution[J].J Dairy Sci,1989.72：1637–1646.

[6]WILDE CJ,KNIGHT CH,FLINT DJ.Control of Milk Secretion and Apoptosis During Mammary Gland Involution[J].Mammary Gland Biol Neoplasia,1999.4：129-136.

[7]AKERS RM,BEAL WE,MCFADDEN TB,et al.Morphometric Analysis of Involuting Bovine Mammary Tissue After 21 or 42 Days on Non-suckling[J].Anim Sci,1990.68：3604-3613.

[8]GAJEWSKA M,GAJKOWSKA B,MOTYL T.Apoptosis and Autophagy Induced by TGF-B1 in Bovine Mammary Epithelial BMEUV1 Cells[J].Physiol Pharmacol,2005.56（Suppl 3）：143–157.

[9]S?RENSEN MT,N?RGAARD JV,THEIL PK,et al.Cell Turnover and Activity in Mammary Tissue During Lactation and the Dry Period in Dairy Cows[J].Dairy Sci,2006.89：4632–4639.

[10]WILLIAMS GT.Programmed Cell Death Apoptosis and Oncogenesis[J].Cell,1991.65：109.

[11]HOLST BD,HURLEY WL,NELSON DR.Involution of the Bovine Mammary Gland：Histological and Ultrastructural Changes[J].Dairy Sci,1987.70：935–944.

[12]李慶章,高學(xué)軍,趙鋒.乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[13]RUDOLPH MC,MC MANAMAN JL,PHANG T,et al.Metabolic Regulation in the Lactating Mammary Gland：Alipid Synthesizing Machine[J].Physiol Genomics,2007.28：323-336.

[14]MONICA M,KATHRYN L,SCHWERTFEGER,et al.An Atlas of Mouse Mammary Gland Development[J].Mammary Gland Biol,2000.5（2）：227-241.

[15]SORDILLO LM,OLIVER SP,NICKERSON SC.Caprine Mammary Differentiation and Initiation of Lactation Following Prepartum Colchicine Infusion[J].Int Biochem,1984.16：1265-1272.

Study on apoptosis of bovine mammary gland in different development stages

XIAO Yang,LI Qing-zhang,ZHANG Li
（Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

The purpose is to explore the regulation of apoptosis at different developmental stages in dairy cow mammary gland.Normal cow mammary gland tissues of different developmental stages were sliced in frozen.TUNEL was used to detect the apoptosis of mammary cell.The results showed that the virgin mammary gland developed slowly,little changes in mammary gland,and at this time,no apoptosis was detected.In pregnancy,mammary gland ductal continued to grow,and apoptosis increased.In initial pregnancy 2m,there were a lot of gland alveolus and simultaneously adipocyte apoptosis began to increase,and appearing a secondary apoptosis peak.In lactation,the structure and function of mammary gland were most complete,no changes in mammary gland structure and apoptosis level was low.In involution,gland alveolus collapsed and a lot of cells were apoptosis.In involution 3d,the apoptosis was highest and then decreased.In involution 30d,the mammary gland was recovered and apoptosis decreased.

dairy cow;mammary gland;frozen section;apoptosis;TUNEL

TS252.1

A

1001-2230（2012）09-0019-04

2011-11-11

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2006AA10Z1A4）；黑龍江省博士后基金（LBH-Z09270）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（LXT005-1-1/-2）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（190106）資助。

肖陽（1985-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿橄侔l(fā)育與泌乳功能調(diào)控。

李慶章