陳伶利 ，李 杰 ，賀氣志 ，陳 輝 ，毛平道 ，鄧 樂 *

（1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208）

基于核酸適配體－熒光染料EvaGreenTM快速檢測ATP的研究

陳伶利1,2，李 杰2，賀氣志1，陳 輝1，毛平道1，鄧 樂1*

（1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208）

目的 利用熒光嵌入染料EvaGreenTM在單雙鏈DNA溶液中不同的熒光性質(zhì)構(gòu)建基于核酸適配體的ATP檢測體系，建立一種簡單、高效的檢測ATP的新方法。方法 利用ATP核酸適配體雙鏈DNA（dsDNA）和核酸綠色熒光染料Eva GreenTM嵌合作用，實(shí)現(xiàn)了對ATP的檢測?？疾炝薃TP的孵育溫度、pH、濃度等因素對熒光強(qiáng)度的影響,并對該方法的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果 反應(yīng)體系在12℃，pH 7.5條件下具有最佳實(shí)驗(yàn)效果，在最優(yōu)條件下，最低能檢測10-6mol/L的ATP，并具有較高的特異性。結(jié)論 本研究為ATP的快速檢測提供了一種易于操作、低成本的新方法。

核酸適配體；EvaGreenTM；ATP；檢測

腺嘌呤核苷三磷酸 (adenosine-triphosphate,ATP)在生物體與外界進(jìn)行物質(zhì)和能量交換的過程中，起著重要的橋梁、紐帶作用，它是生物體各種生命活動能量的直接來源，因此在很多的生物反應(yīng)檢測中ATP是一項(xiàng)重要的檢測內(nèi)容[1-2]。目前，檢測ATP的方法主要有電泳法、光學(xué)分析法、層析法、生物發(fā)光法(熒光素酶法)等，但是以上方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，且靈敏度不高；2009年 Li W等人提出用金納米粒子來檢測ATP，可以檢測到1～10mmol/L的ATP，大大提高了檢測靈敏度，但此方法需要制備特異的核酸修飾的金納米探針，檢測成本較高[3]。Huizenga和 Szostak于1995年通過SELEX技術(shù)篩選出ATP/Adenosine適配體[4]，基于適配體技術(shù)的檢測研究受到了極大的關(guān)注[5-7]。2008年Zhang Chen等將量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體生物傳感器用于ATP檢測[8]，2009年孫波等用高靈敏適配體電化學(xué)發(fā)光生物傳感器來檢測血樣中的ATP[9]，但是這些方法需要使用特殊試劑，分析成本較高。染料Eva GreenTM是一種綠色熒光核酸染料，它有良好的熱穩(wěn)定性和水解穩(wěn)定性，為常規(guī)操作提供了便利，而Eva GreenTM本身沒有熒光，與dsDNA嵌合后能發(fā)出高亮度的熒光，但當(dāng)dsDNA轉(zhuǎn)化為ssDNA后熒光強(qiáng)度將大大減弱。與熒光核酸染料SYBRTM GreenⅠ相比，E-va GreenTM可以在更高濃度下使用，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的擴(kuò)增信號[10-12]。

本研究以ATP為目標(biāo)分析物，以核酸適配體-ATP的特異性識別與dsDNA與熒光染料Eva GreenTM的嵌合作用為基礎(chǔ)，發(fā)展了一種簡單、靈敏的熒光檢測新技術(shù)。由于Eva GreenTM與dsDNA嵌合后能發(fā)出高亮度的熒光，但與ssDNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度大大減弱。利用核酸適配體-ATP復(fù)合物的形成所引起的熒光值變化來檢測ATP。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法操作簡單，不需要對樣品進(jìn)行處理，檢測所需時(shí)間短，整個(gè)檢測過程可以在40min內(nèi)完成。同時(shí)具有較高的靈敏性、較強(qiáng)的特異性，最低檢測下限為10～6 M;該方法的建立為ATP的分析檢測提供了新的技術(shù)支持?，F(xiàn)將方法與結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 LS50B型熒光分光光度計(jì)（PerkinElmer，美國）。

1.1.2 試劑 染料Eva GreenTM購自北京美萊博醫(yī)學(xué)有限公司 （Biotium，美國，20×），使用時(shí)稀釋20倍；ATP、GTP、CTP、UTP購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司（BBI公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；緩沖液為0.01moL/L 磷酸緩沖液 （PBS，pH 6.0～8.0）， 均為115℃滅菌20min，冷卻后備用；所有序列（表1）均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，PAGE純化。

表1 ATP核酸適配體序列表

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)的分子識別與檢測原理如圖1所示：利用熒光嵌入染料EvaGreenTM在單雙鏈DNA溶液中不同的熒光性質(zhì)構(gòu)建了基于核酸適配體的ATP檢測體系。由于綠色熒光染料Eva GreenTM與dsDNA的嵌合作用，系統(tǒng)產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號。當(dāng)dsDNA與ATP孵育后，ATP能識別其特異適配體，并形成適配體－ATP復(fù)合物，使DNA雙鏈解鏈，嵌合的熒光染料Eva GreenTM得以釋放，從而導(dǎo)致系統(tǒng)熒光信號驟然減弱，通過檢測系統(tǒng)熒光信號變化強(qiáng)度可定量測定ATP的濃度。

圖1 核酸適配體-ATP復(fù)合物熒光信號傳感技術(shù)原理示意圖

1.3 方法

1.3.1 dsDNA制備 取10μmol的ATP核酸適配體溶液與10μmol/L的互補(bǔ)序列等量混和，4℃過夜，即得10μmol/L的含ATP適配體的dsDNA。

1.3.2 適配體與ATP相互作用 取10μmol的dsDNA 5 μL于1.5 mL EP管中，再分別加入0.01moL/L PBS（pH 7.5）589 μL，不同濃度 ATP 6 μL，對照管以等體積PBS代替ATP。于12℃孵育1 h。

1.3.3 熒光值的檢測 分別取與ATP孵育后的溶液及對照管溶液各197.5 μL，并加入 2.5 μL Eva GreenTM，振蕩10min后在熒光分光光度計(jì)上分別測其熒光值，調(diào)激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為525 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 孵育溫度對于熒光強(qiáng)度的影響

反應(yīng)溫度對適配體與ATP的結(jié)合能產(chǎn)生一定的影響。將dsDNA與ATP反應(yīng)體系置于不同溫度下反應(yīng)，檢測熒光信號變化值，確定該反應(yīng)的最佳孵育溫度。室溫（約12℃）為最佳的孵育溫度。溫度較低或較高時(shí)，dsDNA的解鏈不完全，與其嵌合的熒光染料Eva GreenTM釋放量少，從而檢測到的熒光信號變化不顯著，見圖2。

2.2 不同pH值對于熒光強(qiáng)度的影響

圖2 孵育溫度對熒光影響強(qiáng)度的柱形分析圖

在反應(yīng)體系中，不同的pH值的PBS緩沖液對熒光強(qiáng)度的檢測也具有顯著的影響。在空白熒光為489.38 的條件下，pH 6.0、 6.5、 6.8、 7.0、 7.3、7.5、8.0所測得的熒光值分別為 358.02、288.04、276.34、266.83、236.64、183.26、226.04 au,實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值。該結(jié)果表明：pH值為7.5時(shí)，反應(yīng)檢測所得的熒光強(qiáng)度最低，即熒光變化值最大，說明在pH 7.5時(shí)，緩沖液對反應(yīng)體系的影響最小。這是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度的變化決定于Eva GreenTM的釋放量，而Eva GreenTM的釋放量又受適配體－ATP結(jié)合程度的影響，而pH值能夠影響適配體－ATP復(fù)合物的解離，在pH 7.5時(shí)，適配體－ATP復(fù)合物的解離程度最小，因此該pH是本反應(yīng)體系的最適值，見圖3。

圖3 pH值對熒光強(qiáng)度檢測影響的散點(diǎn)分析圖

2.3 線性范圍及檢出下限

考察了ATP的濃度對于反應(yīng)體系熒光信號檢測的影響。在空白熒光為489.38，背景信號為13.57的條件下，隨著ATP濃度的減小，所測得的熒光信號與空白對照的變化值越來越小，當(dāng)ATP濃度為10-7mol/L時(shí)，所測結(jié)果與10-6mol/L變化很小，趨近為零，說明對10-7mol/L的檢測無意義，見圖4。

2.4 ATP特異性檢測

圖4 ATP濃度對于熒光強(qiáng)度影響的散點(diǎn)分析圖

為了檢驗(yàn)本體系對ATP檢測的特異性，實(shí)驗(yàn)還考察了不同濃度的其他同類型NTP分子，即CTP、GTP、UTP分子。將NTP分子與實(shí)驗(yàn)所用的核酸適配體在相同條件下反應(yīng)，并檢測它們的熒光信號變化值。實(shí)驗(yàn)測得dsDNA的起始熒光強(qiáng)度為481。通過4組不同濃度NTP分子檢測結(jié)果的對比，隨著濃度的變化，對照組CTP、GTP、UTP的熒光信號有緩慢上升的趨勢，但變化不明顯。這是因?yàn)镃TP、GTP、UTP在結(jié)構(gòu)上與ATP存在一定的相似性，能與ATP適配體存在一定程度的結(jié)合，因而釋放出少量的染料，使熒光信號出現(xiàn)少量變化。而在實(shí)驗(yàn)組隨著ATP濃度的減小，熒光強(qiáng)度有明顯增大，也就是說隨著ATP濃度的減小，熒光信號變化值也變小。以上結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)建立的熒光傳感技術(shù)對于ATP分子檢測具有較高的特異性，見圖5。

圖5 ATP特異性檢測折線圖

3 討論

本研究基于核酸適配體-ATP復(fù)合物與綠色熒光染料Eva GreenTM作用，建立了熒光信號檢測技術(shù)的新方法。

本研究優(yōu)化了核酸適配體與ATP結(jié)合反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，核酸適配體與ATP反應(yīng)的最適溫度為12℃；pH值為7.5時(shí)，熒光檢測結(jié)果最靈敏；在最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，隨著ATP濃度的減小，所測得的熒光信號與空白對照的變化值變小，當(dāng) ATP 濃度從 10－6mol/L 到 10－2mol/L 變化，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度隨著濃度的減小而增大，呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。因此可作為該范圍濃度的ATP檢測新方法。體系還對該方法的特異性作出了探討，采用與ATP同類型分子CTP、GTP、UTP作為對照，根據(jù)檢測出的結(jié)果證實(shí)該核酸適配體對與ATP分子的檢測具有較強(qiáng)的特異性。

本研究所建立的基于核基于核酸適配體-ATP特異識別的熒光傳感技術(shù)，對于ATP分子的檢測相較于其他的檢測方法，不僅反應(yīng)體系特異性高，并且實(shí)驗(yàn)操作簡單，耗時(shí)少，成本低?？梢?，本研究為之后的分子識別檢測提供了更為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Study of rapid detecting ATP based on aptamer and DNA-specific dye EvaGreenTM

CHEN Ling-li,LI Jie,HE Qi-zhi,CHEN Hui,MAO Ping-dao1,DENG Le
(College of Life Science,Hunan Normal University,Changsha,Hunan 410081,China)

Aptamer;Eva GreenTM;ATP;detection

Q-331

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.002.006.04

〔Absrract〕Objective To develop a simple,efficient fluorescence detection technology for ATP.Methods The DNA-intercalating dye Eva GreenTMaptamer-ATP complex was used to detect quickly ATP.The effects of temperature,concentration,pH and reaction time were studied.Results The reacting system was that the best temperature and pH were 12℃and pH7.5,The ATP at limitation 10～6moL/L was detected with optimized conditions.Conclusion This research provides a kind of easy operation and low cost method for ATP rapid detection.

2011－01－06

國家科技部863計(jì)劃資助項(xiàng)目（2007AA062Z403）。

陳伶利（1979－），女，湖南株洲人，博士，主要從事病原微生物檢測技術(shù)研究。

*鄧 樂，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：dengle@hunnu.edu.cn。

（本文編輯 彭芝配）