張海鋒,何紅秋,劉 斌,楊 東,張小軼,譚建軍,陳慰祖,王存新

(基礎(chǔ)研究)

人免疫缺陷病毒-1p66蛋白在大腸埃希菌中低溫長時間誘導(dǎo)表達和活性鑒定

張海鋒,何紅秋,劉 斌,楊 東,張小軼,譚建軍,陳慰祖,王存新

目的人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,H IV)-1逆轉(zhuǎn)錄酶是由 p66和 p51亞單位組成的異二聚體,抑制其活性可阻斷 H IV-1的復(fù)制,是治療獲得性免疫缺陷綜合征 (acquired immunodeficiency syndrome,A IDS)的重要靶點。獲得大量純化的 H IV-1 p66亞單位蛋白有助于研究其活性,為抗 H IV-1藥物研究提供藥物篩選平臺。文中構(gòu)建 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因的原核表達系統(tǒng),獲取高純度高活性的 H IV-1 p66亞單位重組蛋白。方法用 PCR從含 H IV-1 HXB2標準株全基因的質(zhì)粒中擴增出編碼 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位的基因,通過酶切、連接等方法構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-p66,并轉(zhuǎn)化到宿主菌大腸埃希菌BL21(DE3)中,用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達。表達產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析純化后獲得 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白。結(jié)果所構(gòu)建了 pET-28a(+)-p66質(zhì)粒酶切片段為 1680 bp,測序符合 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位編碼基因序列。在 IPTG誘導(dǎo)下表達相對分子質(zhì)量為 66 000的 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白。結(jié)論 成功構(gòu)建了 pET-28a(+)-p66質(zhì)粒,具有較高的 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白表達效率及活性。

人免疫缺陷病毒;逆轉(zhuǎn)錄酶;原核表達;純化

0 引 言

H IV感染可導(dǎo)致 A IDS。H IV進入宿主細胞后在逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase,RT)的作用下完成逆轉(zhuǎn)錄過程。H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶具有 3種活性:RNA依賴的DNA聚合酶活性、DNA依賴的DNA聚合酶活性和 RNase H活性[1-2],催化 H IV-1的單股正鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成為前病毒雙鏈 DNA。阻斷 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性可阻斷 H IV-1的復(fù)制,因此 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶是A IDS治療的重要靶點。

H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶是pol基因編碼產(chǎn)物的一部分,由 p66和 p51亞單位組成異二聚體。其中 p51亞單位是 p66亞單位 C末端 RNase H結(jié)構(gòu)域在蛋白酶切割后形成的產(chǎn)物。p66亞單位含兩個催化結(jié)構(gòu)域:聚合酶結(jié)構(gòu)域和 RNase H結(jié)構(gòu)域。p51亞單位只含有聚合酶結(jié)構(gòu)域,在 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶異二聚體中僅起輔助作用[3]。H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66蛋白在感染細胞中表達含量很低。為了進一步研究其生物學(xué)性質(zhì),為建立以逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點的抗 H IV-1藥物篩選平臺,必須在體外獲得大量純化的 H IV-1 p66亞單位蛋白。文內(nèi)采用大腸埃希菌 BL21(DE3)原核表達系統(tǒng),通過低溫長時增加蛋白的可溶性,用鎳瓊脂糖凝膠載體純化,獲得大量可溶性 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 工具酶和試劑 質(zhì)粒 pET-28a(+)購自 Novagen公司,限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司,TaqDNA聚合酶購自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司,PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自Axygen公司,質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司,E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞、DNA及蛋白質(zhì)分子量標準購自天根生化科技有限公司,鎳瓊脂糖凝膠 FF購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司,InVisionTMHis-標記膠內(nèi)染色試劑盒購自 Invitrogen公司。

根據(jù)目的蛋白序列特點,并參考 pET-28a(+)載體的多克隆酶切位點信息設(shè)計引物并引入N deI和BamH I雙酶切位點。所用引物設(shè)計、合成及p66基因擴增產(chǎn)物序列測定均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。

1.2 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)H IV-1 HXB2p66基因讀碼框設(shè)計擴增引物,上游引物:5′-CTG CAT ATG(NdeI位點)CCCATT AGCCCT ATTG AGACTGTACC-3′,p66下游引物:5′-T ATGGATCC(BamHⅠ位點)TT A(終止密碼子)TAGTACTTTCCTGATTC CAGC-3′。PCR產(chǎn)物為 1680 bp的全長p66基因,切膠回收后以NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切,產(chǎn)物與經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切的 pET-28a(+)載體連接。將所獲 pET-28a(+)-p66質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中,用含 50μg/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選。挑取陽性克隆,用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,進行NdeI/BamH I雙酶切鑒定,對含有目的基因片段的克隆進行DNA序列測定,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白的表達和檢測 將測序正確的含有重組表達質(zhì)粒的大腸埃希菌按 1%比例接種于含 50μg/ml卡那霉素的 SB培養(yǎng)基中,于37℃搖床 200 rpm培養(yǎng)至菌液 OD值達 0.6(600 nm),加入 IPTG至終濃度為 0.5mmol/L,于 25℃搖床 150 rpm誘導(dǎo) 24 h。收集菌體并用預(yù)冷的 PBS洗 1次,重懸于 pH 8.0含 0.3 g/L溶菌酶的平衡液 (20 mmol/L Tris,1 mol/L NaCl,10%甘油,2 mmol/Lβ-巰基乙醇,5 mmol/L咪唑,)中,反復(fù)凍融 3次并超聲破碎細菌 (超聲 8 s、間歇 8 s,50次,最大功率 400W),4℃離心半徑 97mm,8000 r/mm離心 30 min,收集上清液。經(jīng)過濾紙過濾后上樣于鎳瓊脂糖凝膠柱,分別用含 30、60、100、200 mmol/L咪唑的A液進行梯度洗脫,收集洗脫液并進行 SDS-PAGE分析(12%分離膠),用 InVisionTMHis-標記膠內(nèi)染色試劑盒染色。鑒定含目的蛋白的洗脫液,按 1∶500用 PBS透析后備用。取離心后的上清和沉淀進行 SDS-PAGE。

1.4 重組 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白逆轉(zhuǎn)錄活性檢測 用RT-PCR檢測制備的 H IV-1 P66蛋白的酶活性。用Trizol法從新鮮豬肝組織提取總 RNA。以提取的豬肝細胞基因組RNA為模板,豬血清白蛋白(pig serum albumin,PSA)基因的擴增引物序列為:PSA-P1:5′-GCTCTAGATTCGAAACCATGAAGTGGG TG ACTTTTA-3′;PSA-P2:5′-CGGAATTCGGATCCACCACCACCGGCTAAGATC CCTCGAAT-3′。cDNA合成步驟如下[4-6]:將 2μl總RNA加入0.5ml ependoff管,再依次加入 4μl 25 mmol/L Mgcl2,0.8μl PS A-P2,2μl 10 mmol/L dNTP,2μl 10×AMV buffer,0.6μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶或4μl重組H IV-1 P66蛋白,0.5μl重組Rasin核糖核酸酶抑制劑,最后加經(jīng)焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)處理過的雙蒸水至總體積為 20μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:42℃60min,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),95℃2min,逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)。PCR擴增反應(yīng)體系總體積 100 μl,包括10μl cDNA溶液(逆轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA稀釋至100μl,取 10μl),特異性上下游引物各 0.5μl(100 μmol/L),1μlTaq Mix(2×),10μl 10×Taq Mixbuffer,加雙蒸水至100μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5min, 94℃變性60 s,50℃退火50 s,72℃延伸120 s,循環(huán)擴增30次;最后72℃延伸5min。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié) 果

2.1 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因克隆和表達質(zhì)粒的構(gòu)建用上、下游引物進行 PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定表明,擴增產(chǎn)物為 1680 bp的陽性條帶,與已知 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶p66基因長度一致,見圖 1。將 PCR產(chǎn)物與 pET-28a(+)載體連接后,挑選出 1個克隆,用p66引物進行 PCR鑒定,PCR產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定,與已知H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶p66基因序列一致。

圖 1 重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-p66NdeⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定Figure 1 Restriction enzyme digestion analysis for pET-28a(+)-p66

2.2 重組 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白的 IPTG誘導(dǎo)表達條件和產(chǎn)物鑒定 在 IPTG終濃度為 0.5 mmol/L、溫度 25℃、時間 24 h條件下,可溶性蛋白表達量最高,且在以后的純化過程中可避免變性復(fù)性步驟,減少蛋白活性丟失。含 100mmol/L咪唑的洗脫液可洗出大量目的蛋白。含有目的蛋白的收集液用PBS以 1∶500(v/v)透析 24 h。透析后的蛋白分裝保存于 -80℃。用 12%SDS-PAGE鑒定,經(jīng) InVisionTMHis-標記膠內(nèi)染色試劑盒染色,在波長 302 nm處檢測。表達蛋白的相對分子質(zhì)量為66000,據(jù)此判斷為目的蛋白,見圖 2。

圖 2 重組 HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白的 SDS-PAGE結(jié)果Figure 2 12%SDS-PAGE analysis of the prote in expression and purification,the gel was sta ined by In-VisionTMHis-tag I n-gel Sta in

2.3 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白逆轉(zhuǎn)錄活性的檢測 用Trizol方法從新鮮豬肝組織中提取總 RNA。用所制備的重組 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位對豬肝細胞總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA,再用豬血清白蛋白基因的測序引物 PSA-P1和 PSA-P2進行 RT-PCR,得到 1821 bp的擴增片段。用 Promega公司提供的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶對豬肝細胞總 RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后獲得同樣大小的擴增片段,表明重組 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶具有生物活性,見圖 3。

圖3 RT-PCR活性檢測結(jié)果Figure 3 The activity result by RT-PCR

3 討 論

H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66蛋白在體內(nèi)的表達量較低,因而研究較為困難,但該蛋白相對保守,現(xiàn)已在體外用原核或真核表達系統(tǒng)成功地表達了 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66蛋白[7],但制備重組蛋白的過程中還存在一些問題,如標簽無法去除[8],純化步驟復(fù)雜,真核系統(tǒng)表達的蛋白活性與原核系統(tǒng)相比較低。本研究采用了原核系統(tǒng) pET-28a(+)表達載體,由于 pET-28a(+)載體表達的重組蛋白帶有可與鎳瓊脂糖凝膠特異結(jié)合的 His標簽,高濃度咪唑可將與鎳瓊脂糖凝膠柱結(jié)合的目的蛋白洗脫,從而簡化了純化步驟,一步性完成純化過程。

柯越海等[9]以包涵體形式表達純化的 p66蛋白,蛋白純化過程中須對包涵體進行變性、復(fù)性,操作復(fù)雜且耗時費力。包涵體變性后蛋白質(zhì)復(fù)性效率不高,會出現(xiàn)錯誤折疊或不折疊,影響純化后 p66蛋白的功能活性。本研究采用低溫過夜誘導(dǎo) p66蛋白表達,從圖 2可見。從破碎細胞上清液中純化的p66蛋白含量高于從沉淀中純化的蛋白量,表明低溫長時間誘導(dǎo)可使 p66蛋白表達量明顯提高。

1989年,齊多夫定 (zidovudine,AZT)獲得美國FDA批準上市用于艾滋病的治療,是第一個獲得FDA批準使用的抗艾滋病藥物。逆轉(zhuǎn)錄酶是抗 H IV藥物的重要靶點,AZT就是以逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點的 H IV抑制劑,是治療艾滋病的主要藥物。當前廣泛使用的行之有效的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法 (highly active antiretroviral therapy,HAART,俗稱雞尾酒療法)推薦使用至少1種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。隨著抗病毒藥物的廣泛使用,耐藥突變株的逐漸出現(xiàn),亟待發(fā)現(xiàn)新藥物來控制耐藥性病毒株[10]。H IV-1在人體內(nèi)的復(fù)制過程依賴逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的相互作用[11],阻斷逆轉(zhuǎn)錄酶與整合酶的相互作用可有效地阻斷病毒在體內(nèi)的復(fù)制,以逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的相互作用為靶點進行藥物篩選將成為今后的研究熱點。本實驗室已經(jīng)建立了以 gp41蛋白和整合酶為靶點的藥物篩選平臺[12]。本研究獲得了純化的 p66蛋白,表達的 H IV-1 p66蛋白經(jīng)鑒定具有體外逆轉(zhuǎn)錄酶活性,為研究整合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶的相互作用并以這種相互作用為靶標進行研究提供了材料。本研究也有助于進一步研究逆轉(zhuǎn)錄酶與整合酶的相互作用。

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Purification of human immunodeficiency virus-1 p66 protein expressed at low temperature and long-t ime induction and the identification of its biological activity

ZHANG Hai-feng,HE Hong-qiu,L IU Bin,YANG Dong,ZHANG Xiao-yi,TAN Jian-jun,CHEN Wei-zu, WANG Cun-xin
(College of L ife Science and B ioengineering,Beijing University of Technology,Beijing100124,China)

ObjectiveReverse transcriptase,a heterodimer composed of subunits p66 and p51,is considered as an important target forA IDS therapy.H IV-1 replication can be blocked by inhibition of the reverse transcriptase activity.The obtainmentof purified H IV-1 p66 protein will help to study its activity and develop a screening assay for anti-H IV-1 drugs.In the present study,we constructed a p66 prokaryotic expression plas mid,and obtained highly pure and active H IV-1 p66 recombinant protein. Methods The sequence encoding H IV-1 p66 protein was amplified by PCR from the plasmid containing the H IV-1 HXB2 genome,and then cloned into the pET-28a(+)vector by restriction enzyme digestion and ligation to construct the prokaryotic expression plasmid pET-28a(+)-p66.Then itwas transfor med intoE.coliBL21(DE3)strain.IPTGwas used to induce the expression of p66.Finally,nickel affinity gelwas used to purify the p66 protein.ResultsA 1680 bp fragmentwas identified by restriction enzyme digestion.The sequencing result indicated that the H IV-1 p66 gene was cloned into pET-28a(+)correctly.ConclusionThe prokaryotic expression plas mid pET-28a(+)-p66 was constructed successfully.Highly expressed and active H IV-1 p66 recombinant protein was obtained.

Human immunodeficiency virus;Reverse transcriptase protein;Prokaryotic expression;Purification

R446.62

A

1008-8199(2011)02-0139-04

國際科技合作計劃 (2010DFA31710);北京市自然科學(xué)基金(7082006)

100124北京,北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院[張海鋒(理學(xué)碩士研究生)、何紅秋、劉 斌、楊 東、張小軼、譚建軍、陳慰祖、王存新]

王存新,E-mail:cxwang@bjut.edu.cn

2010-10-26;

2010-11-30)

(責(zé)任編輯:齊 名;英文編輯:郭聯(lián)慶)