江明宏,舒茂琴,覃躍龍,王 倩

(基礎(chǔ)研究)

起始識別復(fù)合物 1對血管平滑肌細(xì)胞增殖活性的影響

江明宏,舒茂琴,覃躍龍,王 倩

目的起始識別復(fù)合物 1(origin recognition complex1,ORC1)與血管平滑肌細(xì)胞增殖密切相關(guān)[1],文中探討ORC1對血管平滑肌細(xì)胞(vascular s moothmuscle cell,VS MC)增殖活性的影響。方法用組織塊貼片法培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VS MC;用流式細(xì)胞術(shù)測定VS MC靜止期和增殖期的細(xì)胞周期,并計(jì)算出不同狀態(tài)的增殖活性;用免疫熒光法測定ORC1在VS MC中的表達(dá)位置,用流式細(xì)胞術(shù)測定不同細(xì)胞周期中ORC1蛋白表達(dá)。結(jié)果靜止期VS MC的增殖活性很低[(10.40±3.52)%],在VS MC中ORC1不表達(dá)或低水平表達(dá)。血清剌激 24 h后,處于增殖期的VS MC的增殖活性明顯增加,達(dá)(33.91±13.42)%,ORC1蛋白表達(dá)也明顯增加(P<0.01)。結(jié)論ORC1可能與VS MC增殖活性有關(guān)。

起始識別復(fù)合物 1;血管平滑肌細(xì)胞;增殖活性;細(xì)胞周期

0 引 言

動(dòng)脈粥樣硬化的過程包括細(xì)胞的激活、遷移、增殖、分化、血管生成、酶反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[1-2],其中VS MC的過度增殖是動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄的共同病理特征之一。抑制VS MC的增殖是防止此類病理生理過程發(fā)生、發(fā)展從而減輕血管重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)。由于VS MC的增殖同時(shí)受到多種血管活性肽和生長因子的作用,故單純阻斷某種細(xì)胞外信號分子或某條信號通路難以獲得相應(yīng)的作用。ORC1[3-5]是ORC真核細(xì)胞 DNA復(fù)制起始蛋白中最大的亞基,前期研究[6]顯示 ORC1參與大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖過程。本研究探討ORC1與VS MC增殖活性的相關(guān)性,為深入研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠 30只,體重 120～150 g,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(軍)2002-007,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證: SYXK(軍)2002-029在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。高糖型(dulbecco′s modified eogle′s medium,DMEM)培養(yǎng)基 (G IB I CO公司),胎牛血清 (杭州四季清公司), RT-PCR試劑盒 (TaKaRa公司),胰酶 (Amerisom公司),TR Ipure試劑盒 (Rothe公司),小鼠抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體 (武漢博士德公司),羊抗人ORC1多克隆抗體(Santa Cruz公司),SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司),FITC兔抗羊 IgG(武漢博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VS MC的培養(yǎng)及鑒定 參照文獻(xiàn)[7]采用組織塊貼壁法進(jìn)行VS MC培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用第5～8代細(xì)胞。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測定血管平滑肌細(xì)胞周期的變化 參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行計(jì)算不同狀態(tài)的增殖活性。常規(guī)傳代,待培養(yǎng)融合50%～60%;無血清培養(yǎng)24h為靜止期,10%FBS進(jìn)行剌激,繼續(xù)培養(yǎng) 24 h為增殖期,并用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測上述靜止期和增殖期VS MC的分布變化,計(jì)算增殖系數(shù) (proliferation index,PI)公式如下:

1.3 免疫熒光法檢測ORC1蛋白表達(dá) ①血清饑餓24 h后,用含 10%FBS的DMEM進(jìn)行血清剌激,分別于血清刺激后 0、24 h用 4%多聚甲醛固定,置37℃孵箱中烘干;②0.01mol/L PBS漂洗 3次 ×5 min;③0.3%Triton X-100透析 20min;④加入羊抗人ORC1多克隆抗體(1∶100)30μl,37℃孵育,1h后轉(zhuǎn)入 4℃過夜;⑤0.01mol/L PBS漂洗 5min×3次;⑥熒光標(biāo)記兔抗羊 IgG(1∶50)30μl,37℃孵育 2 h;⑦0.01mol/L PBS漂洗 5min×3次;⑧小鼠抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體 (1∶100)30μl,37℃孵育, 1 h后轉(zhuǎn)入 4℃過夜;⑨0.01mol/L PBS漂洗 5min× 3次;⑩FITC抗小鼠 IgG(1∶50)30μl,37℃孵育 2 h; 11○0.01mol/L PBS漂洗 5min×3次;漂洗后用甘油封片,在熒光顯微鏡下觀察。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測 ORC1在不同狀態(tài)中血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá) ①血清饑餓 24 h后,用含 10% FBS的DMEM進(jìn)行血清剌激,分別于血清刺激后 0、24 h收集細(xì)胞;②用 0.01 mol/L PBS沖洗 2次,用0.25%胰酶消化細(xì)胞,0.01mol/L PBS沖洗 2次,用 4%多聚甲醛固定大于 30min,0.01mol/L PBS沖洗2次;③0.1%TritonX-100(含 0.1%小牛血清白蛋白)透析 15min,用 0.01mol/L PBS(含 5%小牛血清)沖洗 2遍;④加入羊抗人 ORC1多克隆抗體(1∶1000)50μl,置 4℃過夜;用 0.01mol/L PBS沖洗2遍;加入二抗兔抗羊(1∶512)50μl工作液,置 4℃孵育 15min。0.01mol/L PBS沖洗 2次;⑤用流式細(xì)胞儀調(diào)節(jié)檢測背景后,根據(jù)熒光強(qiáng)度對 ORC1陽性表達(dá)及未表達(dá)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用 SPSS 10.0軟件進(jìn)行。不同細(xì)胞周期相的 DNA含量百分比均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各處理組間均數(shù)比較用單因素方差分析,以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 VS MC培養(yǎng)及鑒定 倒置顯微鏡下觀察, VS MC呈梭形,有 1～2個(gè)核仁。用抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,在熒光顯微鏡下全部細(xì)胞胞質(zhì)可見棕色陽性,證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為VS MC[6]。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測不同狀態(tài) VS MC的細(xì)胞周期無血清培養(yǎng)或 10%血清刺激 24 h后,用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期,并根據(jù)公式計(jì)算 VS MC增殖活性(n=3),結(jié)果見表 1、圖 1。與靜止期 VS MC相比,細(xì)胞增殖活性有顯著性差異(P<0.05)。

表 1 血清刺激不同細(xì)胞周期 VSMC增殖活性(%,)Table 1 Proliferation aetivities of VSMC st imulated by 10%fetal calf serum(%,)

表 1 血清刺激不同細(xì)胞周期 VSMC增殖活性(%,)Table 1 Proliferation aetivities of VSMC st imulated by 10%fetal calf serum(%,)

細(xì)胞周期 靜止期 增殖期G0/G1 87.60±5.80 66.09±13.41 S 3.88±3.40 27.53±16.02 G2/M8.52±3.95 6.38±5.56 PI 10.40±3.52 33.91±13.42

圖 1 血清刺激不同細(xì)胞周期VSMC示意圖Figure 1 VSMC of different all cycles st imulated by 10%fetal calf serum

從表 1可見,無血清培養(yǎng) 24 h后大部分 VS MC增殖活性為 (87.60±5.80)%,處于靜息狀態(tài)(G0/G1期),增殖活性最低。10%血清刺激 24 h,即增殖期,DNA合成增加明顯,G0/G1期 (66.09± 13.41)%VS MC逐漸減少,S(27.53±16.02)%和G2/M期 (6.38±5.56)%逐漸增加,增殖活性增加, VS MC(33.91±13.42)%活性活躍,提示血清刺激24 hVS MC增殖最活躍。

2.3 不同增殖狀態(tài)的 VS MC中 ORC1蛋白表達(dá)[6]在熒光顯微鏡下觀察,抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白為綠色熒光標(biāo)記,在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá);ORC1蛋白為紅色熒光標(biāo)記,在細(xì)胞核中表達(dá),如圖 2A和B所示:饑餓培養(yǎng) 24 h后,處于靜止期的 VS MC抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)呈陽性,但無ORC1表達(dá),故雙通道疊加呈綠色;血清剌激 24 h后,處于增殖狀態(tài)的 VS MC中抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白和ORC1均有大量表達(dá),如圖 2D和 E所示,雙通道疊加細(xì)胞核呈黃色,如圖 2。

用流式細(xì)胞儀監(jiān)測在不同狀態(tài)的 VS MC中ORC1的表達(dá),結(jié)果如圖 3所示。饑餓培養(yǎng) 24 h后ORC1蛋白表達(dá)極弱(0.46%),未顯示;血清刺激后24 h達(dá)到峰值 22.55%。與靜止期 VS MC表達(dá)的ORC1蛋白比較,血清刺激 24 h后 VS MC的 ORC1蛋白表達(dá)量顯著增加,χ2值為 231.000(P<0.01)。與免疫熒光標(biāo)記的結(jié)果一致。

圖 2 抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白和ORC1蛋白在 VSMC中的免疫熒光標(biāo)記(×200)Figure 2 Expression of SMαA and ORC1 by immunocytochem istry(×200)

圖3 ORC1在VSMC不同狀態(tài)的表達(dá)Figure 3 The expression of ORC1 at the different stayes of VSMC

3 討 論

ORC是真核細(xì)胞 DNA復(fù)制的起始蛋白,由 6個(gè)不同的亞單位組成,即ORC1～6都是在酵母菌中以ATP依賴形式結(jié)合在DNA復(fù)制起始點(diǎn)上。起始點(diǎn)由含 11對堿基的保守序列和有關(guān)其他元件組成,其同源復(fù)合體存在于所有的真核生物中[9-10]。ORC1是 6個(gè)亞基中最大的,對啟動(dòng) VS MC的 DNA復(fù)制起重要作用[8]。本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈中膜 VS MC模擬再狹窄病變過程中增殖的VS MC,了解ORC1蛋白表達(dá)情況與其增殖活性的關(guān)系,并觀察血清刺激VS MC對ORC1蛋白表達(dá)和增殖活性的影響,探討血管成形術(shù)后再狹窄的分子病理機(jī)制和治療措施。

有研究認(rèn)為ORC1與VS MC增殖有關(guān),但未見VS MC與其細(xì)胞增殖活性關(guān)系的報(bào)道。本研究用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測靜止期和增殖期的細(xì)胞周期,并計(jì)算不同狀態(tài)的增殖活性。用免疫熒光標(biāo)測檢測表明ORC1與VS MC增殖活性有關(guān)。在靜止期無血清培養(yǎng) 24 h后,大部分 VS MC(87.60±5.80)%處于G0/G1期,處于血清饑餓狀態(tài) (即靜止?fàn)顟B(tài)),增殖活性僅為(10.40±3.52)%,不能測出 ORC1熒光。血清刺激 VS MC24 h后,大部分 VS MC [(66.09±13.41)%]處于 G0/G1期,即在增殖活躍期 DNA合成增加明顯。VS MC以后,S期(27.53±16.02)%和 G2/M期 (6.38±5.56)% VS MC逐漸增加,增殖活性增加,增殖活性達(dá)(33.91±13.42)%,細(xì)胞內(nèi) ORC1表達(dá)明顯。在靜止期VS MC中ORC1表達(dá)為 4.37%。血清刺激24 h后,增殖期 VS MCORC1表達(dá)率為22.55%。與靜止期比較,血清刺激 24 h后的 ORC1蛋白表達(dá)量明顯增加,差異顯著。與免疫熒光標(biāo)記檢測的結(jié)果一致。本研究用免疫熒光法研究VS MC形態(tài)學(xué),結(jié)果表明 ORC1在靜止期表達(dá)的弱或不表達(dá),而在增殖期,同時(shí)在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)。流式細(xì)胞信檢測結(jié)果也表明ORC1蛋白表達(dá)與VS MC增殖活性有關(guān),提示ORC1參與VS MC的DNA復(fù)制的激動(dòng)和細(xì)胞增殖的調(diào)控途徑。

有資料顯示[11],經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后血管平滑肌細(xì)胞的異常遷移和過度增殖導(dǎo)致新生內(nèi)膜的過度增生,這是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)特別是支架術(shù)后發(fā)生再狹窄的主要原因。VS MC的周期進(jìn)程與細(xì)胞增殖的關(guān)系在細(xì)胞增殖性疾病中倍受關(guān)注。通過干預(yù)不同細(xì)胞周期中ORC1蛋白的表達(dá),抑制細(xì)胞周期中細(xì)胞增殖的核心過程就成為預(yù)防 RS的有效靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示增殖活性低的 VS MC無ORC1表達(dá)或僅有弱表達(dá),而增殖活性高的 VS MC則有ORC1的高表達(dá),提示ORC1與VS MC增殖活性有關(guān),故推測ORC1是VS MC增殖或增生信號與細(xì)胞周期之間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子,但 ORC1在血管平滑肌細(xì)胞增殖過程中的具體調(diào)控機(jī)制和關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚需要進(jìn)一步深入探討。

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Effection of ORC1 during the proliferation of vascular smooth muscle cells

J IANGMing-hong1,SHU Mao-qin2,Q IN Yue-long2,WANGQian2
(1.The252nd hospital of PLA,B aoding071000,Hebei,China;2.Depar tm ent of Cardiology,South-west Hospital, Third Military Medical University,Chongqing400038,China)

ObjectiveOrigin recognition complex1(ORC1)had been corcerned with the vascular muscle cell(VS MC)of proliferation.To explore ORC1 effection in proliferation index ofVS MC. Methods VS MC of rat thoracic aorta was obtained by the adherence method of tissue culture.The different stages ofVS MC proliferation were determined by flow cytometry;The protein expression ofORC1 was observed by immunocytochemistry.ResultsCultured VS MC was confir med by lightmicroscope and immunocytochemistry.the ration of proliferation during the quiescence stage ofVS MC was(10.40±3.52)%,The protein expression ofORC1 was low or not found;After VS MC was stimulated with serum,the ration of proliferation during the proliferation stage of VS MC was (33.91±13.42)%,protein expression ofORC1 increased significantly at 24 hour(P<0.01).ConclusionORC1 may have concerned with the the proliferation of different process ofVS MC.

Origin recognition complex 1;Vascular smooth muscle cells;Proliferation index;Cell cycle

R329.28

A

1008-8199(2011)02-0131-04

國家自然科學(xué)基金(30470727)

071000保定,解放軍 252醫(yī)院心內(nèi)科[江明宏 (醫(yī)學(xué)碩士研究生)];400038重慶,第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院心血管內(nèi)科(舒茂琴、覃躍龍、王 倩)

舒茂琴,E-mail:Shumaoqin@sina.com

2010-07-18;

2010-08-11)

(責(zé)任編輯:齊 名;英文編輯:徐 軍)