高宏 贠亞波 兀江波 曹霞萍

AB-8大孔樹脂對甘草提取液的最佳動態(tài)純化條件

高宏 贠亞波 兀江波 曹霞萍

為優(yōu)選出AB-8型大孔樹脂對甘草酸的最佳動態(tài)吸附及解吸條件。我們采用正交試驗法優(yōu)選AB-8大孔樹脂對甘草提取物的最佳動態(tài)吸附工藝，采用單因素實驗優(yōu)選解吸純化的最佳工藝進行綜合分析。通過對數(shù)據(jù)的直觀分析和方差分析得出上柱藥液濃度對吸附量有顯著影響，最佳上樣條件為A3B1C2，即上柱液濃度為0.5 g/ml，徑高比為1∶8，流速為2 ml/min為最佳上樣條件，采用30%的乙醇洗脫雜質(zhì)，采用80%的乙醇富集甘草酸。

甘草;甘草酸;正交實驗;AB-8大孔吸附樹脂

甘草為豆科植物甘草的干燥根和根莖。具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的作用;用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性［1］。甘草中含有的主要有效成分為甘草苷、甘草酸等。大孔吸附樹脂是20世紀60年代末在離子交換劑和其他吸附劑應用的基礎上，人工合成的一種新型多孔性高分子聚合物。其巨大的比表面積使其具有良好的吸附性能，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機物質(zhì)，從而達到分離提純的目的。在甘草的有效成分中，甘草酸與甘草酸的含量較多。本實驗采用AB-8大孔吸附樹脂對從甘草中提取的甘草酸進行進一步純化研究。

1 儀器與試藥

儀器：美國惠普HP1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，HP1100/WIND3D化學工作站;AE-240電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。試藥：甘草酸單銨鹽對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110731-200513);甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純;AB-8型((南開大學化工廠);甘草購自亳州永剛藥材總公司，粉碎(過80目篩)，備用。

2 實驗方法和結(jié)果

2.1 甘草酸含量測定方法色譜分析條件色譜柱：HP hypersiL C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱溫為 30℃;流動相為甲醇-0.2 mol/ml醋酸按-0.1%醋酸(60∶40∶0.1);檢測波長250 nm;流速0.8 ml/min;進樣體積10 μl。對照品色譜圖見圖1。

圖1 甘草酸單銨標準品圖

2.2 對照品溶液的制備 取甘草酸單銨鹽對照品5 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備 稱取已粉碎的粗粉甘草，置玻璃層析柱中，加入5倍量的0.5%氨水浸泡6 h后，開始滲漉，收集滲漉液12倍量后，停止?jié)B漉，濃縮滲漉液，以備上樣。

3 實驗方法

3.1 樹脂預處理 乙醇濕法裝柱，用乙醇在柱上流動清洗，不時檢查流出的乙醇液，至乙醇液與水混合(1：5)不呈白色渾濁為止，然后以大量蒸餾水洗去乙醇至無醇昧。再用2BV的5%HCL溶液，以4～6 BV/h的流速通過樹脂層并浸泡2～4 h，再用蒸餾水以同樣流速洗至出水pH呈中性，然后用2 BV的2%NaOH溶液，以4～6 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2～4 h，最后用蒸餾水以同樣流速洗至出水pH值呈中性，樹脂保存在層析柱中備用，

3.2 動態(tài)吸附 為考察上柱條件對樹脂吸附的影響，根據(jù)預試驗結(jié)果，確定上柱樹脂體積50 ml，以徑高比、上樣濃度、流速作為考察因素，建立L9(34)正交試驗，實驗安排見表1、2。以甘草酸到達泄漏點(流出液中目的產(chǎn)物的質(zhì)量濃度達到進樣質(zhì)量濃度的5%時，即為吸附終點，達到吸附終點時得流出液體積定義為泄漏點［2］)時，樹脂柱對甘草酸的吸附總量作為測評指標，確定最佳上樣條件。具體操作：按照正交表安排，選定符合規(guī)格的層析柱，取AB-8大孔吸附樹脂50 ml濕法裝柱，按照正交試驗表安排實驗。每10 ml收集一瓶，標號，每瓶取1 ml，稀釋至5 ml，過濾，測定收集液中甘草酸的濃度，出現(xiàn)泄漏點時停止上樣。結(jié)果見表1、2、3。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表

表2 L9(34)正交實驗方案及結(jié)果

4 討論

4.1 本實驗采用正交試驗優(yōu)選出最佳的動態(tài)吸附條件，同時采用單因素實驗優(yōu)選最佳解吸條件，不僅提高甘草酸的收率，同時純度也有所提高。

4.2 本實驗中利用了不同濃度的乙醇洗脫物質(zhì)的不同，采用低濃度洗脫雜質(zhì)，高濃度洗脫有效成分，使得有效部位的提取成為可能。為中藥有效成份、有效部位的提取、純化、分離及中藥復方藥物的生產(chǎn)研究的進步起到很大的促進作用。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.化學工業(yè)出版社，2010：80.

［2］陳順，關延彬.大孔樹脂吸附骨碎補總黃酮特性的研究.中國中藥雜志，2007，32(8)：750-752.

472000 河南省三門峽市中醫(yī)院

表3 正交試驗方差分析表

注：F0.05(2.2)=19.0

因素 SS f F F0.05顯著性A 109998.96 2 21.841 19.00＊＊B 34877.097 2 6.925 19.00 C 1588.281 2 1.000 19.00 5036.44 2 0.522 19.00 D(誤差)

通過對以上數(shù)據(jù)的直觀分析和方差分析可以看出，影響吸附量的因素主次順序為 A＞B＞C，最佳上樣條件為A3B1C2D2，即當上樣濃度為18 mg/ml，徑高比為1∶8，流速為2 ml/min為最佳上樣條件。按照最優(yōu)條件重復上樣3次，計算對甘草酸的吸附量。結(jié)果如表4。

表4 驗證實驗

709.15 702.65 710.46 1 2 3甘草酸吸附量(mg)實驗編號

驗證實驗表明，優(yōu)選出的吸附工藝穩(wěn)定可靠。由此可以計算出1 ml水飽和的AB-8大孔吸附樹脂可以吸附14.15 mg甘草酸。

3.3 動態(tài)解吸 按照動態(tài)吸附的最佳條件準備7根已達達最大上樣量的柱子，先用蒸餾水2 ml/min洗脫至洗脫液無色，然后分別用20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%以2 ml/min的速度，每25 ml收集為一瓶，過濾后，進行HPLC檢測洗脫液中甘草酸的濃度，繪制動態(tài)解吸圖。見圖2。

圖2 動態(tài)解吸圖

由圖表可知，20%、30%的乙醇洗脫出來的甘草酸的濃度很小，洗脫液顏色由深變淺在75～150 ml時顏色變化不明顯，說明低濃度的乙醇可以洗脫大量的雜質(zhì);而80%的乙醇解吸較快且洗脫劑用量較少，在175 ml時已經(jīng)將甘草酸完全洗脫下來。綜合考慮，確定動態(tài)解吸先用水洗脫至無色后，用30%的乙醇75 ml洗脫雜質(zhì)，然后用150 ml80%乙醇洗脫有效成分。

3.4 驗證實驗 按照最佳動態(tài)吸附條件和最佳解吸條件進行驗證實驗，結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。結(jié)果見表5。

表5 純化驗證試驗

實驗編號 收率 轉(zhuǎn)移率 純度1 3.25% 77% 69.13%2 3.18% 78% 69.16%3 3.50% 78% 68.69%