許崇利,胡靜濤,許崇波
(1.吉林化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,吉林 132022;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長春 130118;3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院,遼寧大連 116622;)
γ干擾素(interferon γ,IFN-γ)是由活化的T細(xì)胞及NK細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能細(xì)胞因子,除了具有抗病毒活性外,還具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用[1-5]。人γ-干擾素作為人體免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞癌、結(jié)腸癌及病毒感染類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性肉芽腫瘤等均有良好的療效,有著較為廣闊的市場(chǎng)前景。由于天然γ-干擾素產(chǎn)量低、不易大量制備,限制了它的研究和臨床應(yīng)用。隨著γ-干擾素基因的克隆和表達(dá)首先由美國Genetech公司的Gray等[6]于1982年完成。γ-干擾素的大批量生產(chǎn)并臨床應(yīng)用日益引起人們的重視。rhIFN-γ具有較高的疏水性,對(duì)宿主菌的毒害作用很大,采用一般的培養(yǎng)技術(shù),重組菌菌體的產(chǎn)量很低,單位發(fā)酵液中目的蛋白產(chǎn)量難以提高。本研究以搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的研究結(jié)果為基礎(chǔ),研究了在搖瓶中不同培養(yǎng)誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)等因素對(duì)工程菌生長和rhIFN-γ表達(dá)的影響,并優(yōu)化了工程菌發(fā)酵參數(shù),為發(fā)酵罐的生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),最終實(shí)現(xiàn)rhIFN-γ的大規(guī)模生產(chǎn)。
1.1 菌株 菌株BL21(DE3)(pET32a(+)-rhIFN-γ)由吉林化工學(xué)院基因工程藥物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[7]。
1.2 培養(yǎng)基 M9Ⅰ培養(yǎng)基:1.6%Tryptone、1%Yeast extract、0.2%K2HPO4、0.1%KH2PO4、0.01%NH4Cl、0.06%(NH4)2SO4、0.05%MgSO4、0.25%Na2HPO4·12H2O。M9Ⅱ培養(yǎng)基:0.5%Glucose、0.5%Yeast extract、0.5%K2HPO4、0.35%KH2PO4、0.35%(NH4)2HPO4、0.025%MgSO4、2 mol/L 大腸桿菌用微量元素。M9Ⅲ培養(yǎng)基:0.5%CA、0.524%K2HPO4·3H2O、0.2%KH2PO4、0.12%(NH4)2SO4、0.05% 無水 MgSO4、0.02%NH4Cl、0.1% 甘油、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1 mol/L CaCl2、2 mol/L大腸桿菌用微量元素。
1.3 主要試劑 IPTG和氨芐青霉素購自Promega公司、酵母粉、蛋白胨等為國產(chǎn)試劑。大腸桿菌表達(dá)載體pET32a(+)及大腸桿菌 BL21(DE3)由吉林化工學(xué)院基因工程藥物實(shí)驗(yàn)室保存。
2.1 搖瓶種子的培養(yǎng) 挑取BL21(DE3)(pET32a(+)-rhIFN-γ)單菌落轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中(50 mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基20 mL(含50 μg/mL氨芐青霉素),37℃ 200 r/min培養(yǎng)12~14 h。
2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液按2%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基含50 μg/mL氨芐青霉素),200 r/min 37℃培養(yǎng),37℃誘導(dǎo)。
2.3 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)rhIFN-γ表達(dá)影響 將種子液按2%接種量分別接種于三種改良的M9培養(yǎng)基(M9Ⅰ、M9Ⅱ、M9Ⅲ)中,于 37 ℃ 200 r/min 培養(yǎng),待菌體密度 OD600達(dá)到1.0時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的 IPTG,繼續(xù)培養(yǎng) 3 h后取樣,SDSPAGE 檢測(cè) rhIFN-γ 表達(dá)量[8]。
2.4 發(fā)酵初始pH對(duì)rhIFN-γ表達(dá)的影響 將M9Ⅲ發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 值分別調(diào)為 6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4 和 7.6,然后分裝于 200 mL 錐形瓶中,每瓶50 mL,按2%接種,于37℃ 200 r/min培養(yǎng),待菌體密度 OD600達(dá)到1.0時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。
2.5 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)rhIFN-γ表達(dá)的影響 將種子液按2%的接種量接種于M9Ⅲ發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37℃ 200 r/min培養(yǎng),待菌體密度 OD600達(dá)到1.0時(shí),分別加入終濃度分別為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mmol/L的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。
2.6 誘導(dǎo)溫度對(duì)rhIFN-γ表達(dá)的影響 將M9Ⅲ發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至7.0,然后分裝于200 mL錐形瓶中,每瓶50 mL,按2%的接種量接種BL21(DE3)(pET32a(+)-rhIFN-γ)種子液,分別于28℃、30℃、32℃、35℃、37℃和40℃ 200 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。
2.7 菌體密度始對(duì)rhIFN-γ表達(dá)的影響 將種子液按2%的接種量接種于M9Ⅲ發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37℃ 200 r/min培養(yǎng),分別于菌體密度OD600達(dá)到0.8、1.0、1.2 時(shí),加入終濃度為 1.0 mmol/L 的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。
2.8 培養(yǎng)和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)rhIFN-γ表達(dá)的影響將種子液按2%的接種量接種于M9Ⅲ發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37℃ 200 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L 的 IPTG,分別于1、2、3、4、5 h 取樣,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。
3.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)rhIFN-γ表達(dá)影響 如圖1~3所示,rhIFN-γ在三種改良的M9發(fā)酵培養(yǎng)基中均有表達(dá),但在M9Ⅲ培養(yǎng)基中的表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,rhIFN-γ蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量45.2%(見圖3)。
圖1 M9Ⅰ培養(yǎng)基rhIFN-γ表達(dá)SDS-PAGE電泳圖
不同的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)rhIFN-γ蛋白表達(dá)量有較大影響,考慮到M9Ⅲ培養(yǎng)基比較廉價(jià),且可以高效表達(dá)rhIFN-γ,所以選擇M9Ⅲ培養(yǎng)基作為小搖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
3.2 發(fā)酵初始pH對(duì)rhIFN-γ表達(dá)的影響 如圖4~6所示,不同初始pH值對(duì)rhIFN-γ蛋白表達(dá)水平有明顯影響,其中pH值為7.0時(shí),rhIFN-γ蛋白表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,rhIFN-γ蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的42.6%(見圖5)。因此選擇pH7.0為最佳初始pH值條件。
圖4 pH6.4、6.6、6.8 發(fā)酵液 SDS-PAGE 電泳圖
圖7 0.4、0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵液 SDS-PAGE電泳圖
3.3 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)rhIFN-γ表達(dá)的影響 如圖7~9所示,不同的IPTG濃度對(duì)rhIFN-γ蛋白表達(dá)量的影響不同,當(dāng)IPTG濃度達(dá)到1.0 mmol/L時(shí)rhIFN-γ蛋白表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,rhIFN-γ蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的51.8%(見圖8)。因此IPTG濃度控制在1.0 mmo/L較好,可以得到更高的表達(dá)水平。
圖10 培養(yǎng)溫度28℃、30℃發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖
3.4 誘導(dǎo)溫度對(duì) rhIFN-γ表達(dá)的影響 如圖10~12所示,不同的培養(yǎng)溫度對(duì)rhIFN-γ蛋白表達(dá)量有較大的影響,當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)rhIFN-γ蛋白表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,rhIFN-γ蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量49.7%(見圖12)。考慮到菌體生長速度,最后確定搖瓶培養(yǎng)溫度為37℃,誘導(dǎo)溫度為37℃。
3.5 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)rhIFN-γ表達(dá)的影響 當(dāng)菌體密度OD600達(dá)到1.0進(jìn)行誘導(dǎo),rhIFN-γ蛋白表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,rhIFN-γ蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的43.5%(見圖13)。在此之前誘導(dǎo)細(xì)胞濃度低,在此之后誘導(dǎo),由于細(xì)胞大量繁殖,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被迅速消耗,加之有害代謝物的積累,使rhIFN-γ的生產(chǎn)能力較低。
3.6 不同培養(yǎng)、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)rhIFN-γ表達(dá)的影響在對(duì)數(shù)生長前期進(jìn)行誘導(dǎo),最有利于菌體生長和產(chǎn)物表達(dá)。只有工程菌處于對(duì)數(shù)生長時(shí)期,目的蛋白表達(dá)水平才最高,一旦工程菌進(jìn)入穩(wěn)定生長期再升溫,目的蛋白表達(dá)水平反而會(huì)迅速下降。如圖14所示,當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為3 h時(shí),rhIFN-γ蛋白表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,rhIFN-γ蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的41.2%。因此,選擇3 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。
本實(shí)驗(yàn)采用的工程菌通過熱誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì),誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間等因素對(duì)菌體的生長密度和目的蛋白表達(dá)水平均有有較大影響。工程菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí),目的蛋白表達(dá)水平最高。誘導(dǎo)太早,菌體密度不高,誘導(dǎo)太遲,表達(dá)量低,本實(shí)驗(yàn)在菌體培養(yǎng)3 h后進(jìn)行誘導(dǎo),rhIFN-γ蛋白表達(dá)量最高。工程菌經(jīng)熱誘導(dǎo)后,細(xì)胞代謝旺盛,產(chǎn)物大量積累,但長時(shí)間高溫誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的生長和質(zhì)粒的穩(wěn)定性都會(huì)產(chǎn)生一定的影響,超過3 h之后,表達(dá)量逐步下降,因此選擇OD6001.0,3 h為合適的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。培養(yǎng)基的pH值將影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用和代謝產(chǎn)物的分泌。細(xì)菌生長最佳pH值為6.8~7.4,過高或過低都不利于菌體的生長,本研究發(fā)現(xiàn),初始pH 7.0時(shí)目的蛋白產(chǎn)量最高。IPTG為有效的誘導(dǎo)劑,但I(xiàn)PTG對(duì)大腸桿菌有一定的代謝毒性,且價(jià)格昂貴,所以確定IPTG的最低有效濃度,一方面可以降低對(duì)大腸桿菌代謝的毒性作用,另一方面可減少誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的費(fèi)用。試驗(yàn)顯示在終濃度為1.0 mmol/L時(shí)產(chǎn)量最大。溫度在誘導(dǎo)過程中除了影響氧的溶解度外,還會(huì)加速或延緩酶的反應(yīng)速率,影響蛋白的性質(zhì)[9]。試驗(yàn)顯示培養(yǎng)和誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高。
摸索搖瓶發(fā)酵條件對(duì)確定發(fā)酵罐發(fā)酵工藝有著一定的借鑒意義,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的發(fā)酵條件為發(fā)酵起始pH值7.0、培養(yǎng)溫度37℃、IPTG誘導(dǎo)濃度1.0 mmol/L、菌體生長密度 OD600達(dá)到 1.0時(shí)加入IPTG、誘導(dǎo)時(shí)間為3 h。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的發(fā)酵條件是穩(wěn)定的,在后續(xù)的工作中,可以此為方向進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的摸索,從而為rhIFN-γ批量生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。
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