張文慧，錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種禽類的急性、烈性傳染病，除了可感染禽類外［1］，還可感染人、豬和馬等多種動物，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報的疾?。?］。禽流感在世界各地暴發(fā)［3］，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自從1997年，有了人感染禽流感并致死病例的報道［4－5］，H5N1亞型禽流感病毒被普遍認(rèn)為極有可能是下一次禽流感大流行的罪魁禍?zhǔn)祝?］，嚴(yán)重威脅著人類的生命安全。大多數(shù)研究學(xué)者認(rèn)為研制有效的流感疫苗是預(yù)防禽流感發(fā)生與傳播的重要手段［7－11］。禽流感的疫苗研究主要有全病毒滅活疫苗、基因工程重組病毒滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活載體疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、反基因工程疫苗、抗獨特性抗體疫苗、表位疫苗等。

表位疫苗是近幾年發(fā)展起來的一種獨特疫苗，它是以抗原表位為基礎(chǔ)制備的疫苗。免疫細(xì)胞通常難以借助其表面受體識別整個抗原分子，而是識別抗原大分子上的一些特定的免疫活性基團(tuán)并與其進(jìn)行反應(yīng)?？乖肿又羞@些負(fù)責(zé)和免疫細(xì)胞的抗原受體或抗體分子相結(jié)合，決定該抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)稱為表位。抗原表位是T細(xì)胞抗原受體和B細(xì)胞抗原受體及抗體特異結(jié)合的基本單位，在免疫應(yīng)答中，根據(jù)T、B細(xì)胞抗原受體所識別的抗原表位的不同，分別稱為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。文章就近年來禽流感表位疫苗的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 表位的篩選方法

目前研究報道的篩選表位疫苗候選表位的方法有單抗法、生物信息法、異源抗體對接法等。宋建領(lǐng)等［12］采用針對禽流感病毒M1蛋白的型特異性單克隆抗體，淘選M13噬菌體展示的12肽隨機(jī)肽庫。結(jié)果篩選到M1蛋白222～230位氨基酸(HPNSSARLR)序列構(gòu)成了流感病毒型特異性表位。還有不少學(xué)者應(yīng)用生物信息學(xué)的方法預(yù)測禽流感病毒的表位。王國戧等［13］應(yīng)用免疫信息學(xué)的方法尋找不同來源的H5N1亞型禽流感病毒血凝素(HA)的共同抗原表位。從GenBank下載不同來源的H5N1亞型禽流感病毒血凝素(HA)的氨基酸序列，使用ClustalW1.83和SYFPEITHI生物學(xué)軟件進(jìn)行分析，選擇和MHC I類分子結(jié)合比較強(qiáng)的抗原肽，有可能發(fā)展為H5N1亞型禽流感病毒表位疫苗，用來預(yù)防H5N1亞型禽流感。白靚等［14］使用生物信息學(xué)方法，對所下載序列進(jìn)行預(yù)測與分析，獲得H7N7亞型禽流感病毒血凝素B細(xì)胞和Th細(xì)胞相關(guān)抗原表位。通過H7亞型禽流感病毒陽性血清，初步驗證所選表位抗原性。獲得了5個H7N7亞型禽流感病毒候選B細(xì)胞和Th細(xì)胞表位。王開艷等［15］用生物信息學(xué)方法預(yù)測H1N1亞型流感病毒血凝素T和B細(xì)胞相關(guān)抗原表位，獲得了三條候選Th和B細(xì)胞表位。梁瑾等［16］嘗試用異源抗體對接方法對流感病毒血凝素B細(xì)胞構(gòu)象表位預(yù)測進(jìn)行可行性分析，基于蛋白質(zhì)相互作用界面的形狀互補(bǔ)理論，使用異源抗體的晶體結(jié)構(gòu)同流感病毒血凝素的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行剛性分子對接。李新生等［17］用禽流感病毒T細(xì)胞表位與體外重建雞MHC I類分子結(jié)合的方法鑒定篩選的抗原表位多肽。篩選出KILTIYSTV和LLLAIVSLV兩條禽流感病毒的候選表位。

2 表位疫苗的候選基因

禽流感病毒是負(fù)義的單鏈RNA病毒，基因組分為8 個節(jié)段，依次為 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS。HA(血凝素)蛋白是流感病毒的主要保護(hù)性抗原，同時也是流感病毒抗原亞型分類的一個重要標(biāo)記性抗原，可誘生保護(hù)性抗體及細(xì)胞免疫［18］，是當(dāng)前流感疫苗的主要成分。目前禽流感疫苗的開發(fā)研制都主要是針對該蛋白的［19］。宋慧娟等［20］對禽流感病毒HA模擬表位的研究與性質(zhì)的分析及類病毒顆粒融合蛋白的表達(dá)與活性分析、免疫原性分析，都為研制禽流感表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

NA(神經(jīng)氨酸酶)是流感病毒表面的另一類糖蛋白，其數(shù)量沒有HA多，能促使被感染細(xì)胞釋放出新產(chǎn)生的病毒顆粒，是流感病毒繼續(xù)擴(kuò)散和繁殖必不可少的。有的表位疫苗設(shè)計是針對NA蛋白的［21］。

在流感病毒的各個基因中，NP基因最保守，具有型特異性，根據(jù)其抗原性的不同，可將流感病毒分為A、B、C三個型。M的氨基酸序列很保守，在所有的禽流感病毒中，其序列幾乎完全相同。針對NP和M蛋白設(shè)計的表位疫苗可以在不同亞型的禽流感病毒間通用。Guus F等［22］認(rèn)為當(dāng)禽流感疫情暴發(fā)體液免疫抵抗流感病毒是不夠的，因此選擇高度保守的M和NP蛋白的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位是非常必要的。鄧路瑤等［23］在A型流感病毒M1蛋白中找到了保守且有很強(qiáng)免疫原性的T細(xì)胞表位，并成功插入沙門氏茵SEF17茵毛基因agfA中。Bodewesa等［24］篩選出了 NP383～391一段9肽序列的CTL細(xì)胞表位。

僅針對禽流感病毒的單個抗原基因設(shè)計的表位疫苗，雖然也能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，但忽略了禽流感病毒的其他抗原成分。多表位疫苗是將禽流感病毒抗原基因中的抗原活性部位(包括B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位)串聯(lián)在一起并插入真核表達(dá)質(zhì)粒中構(gòu)建而成的，避免了將多個抗原基因克隆入同一載體的困難以及可能引起的轉(zhuǎn)錄干擾問題［25］，而且不必構(gòu)建多個單一質(zhì)粒進(jìn)行混合免疫就可充分發(fā)揮病原體中各個抗原成分的作用。Pushko等［26］將HA、NA和 M1蛋白的部分表位組合到一起，設(shè)計多表位疫苗。陳義鋒等［27］篩選流感病毒主要抗原(HA、NA、NP、M)表位基因，以生物信息學(xué)軟件優(yōu)化其排列結(jié)構(gòu)，合成流感通用的復(fù)合多表位基因，構(gòu)建抗A型流感H3、H5、H7、H9亞型的重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK細(xì)胞)，檢測到有效地轉(zhuǎn)錄和表達(dá);而且其表達(dá)產(chǎn)物均能與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合，證明了其具有一定的生物學(xué)活性和抗原性，有望成為抗多種A型流感病毒的通用表位疫苗。

3 表位疫苗的免疫效果

Pushko等［26］將針對禽流感病毒 HA、NA和M1蛋白的部分表位設(shè)計的多表位疫苗免疫BALB/c小鼠，具有良好的免疫效果。李新生等［28］對體外鑒定的禽流感病毒T細(xì)胞表位的免疫效果進(jìn)行了研究。將來源于禽流感病毒的、可與雞MHC I類分子結(jié)合的KILTIYSTV和LLLAIVSLV多肽免疫BALB/c小鼠，免疫后IFN－7的分泌量顯著增長，能引起CD8+T淋巴細(xì)胞的額外增殖，刺激小鼠產(chǎn)生特異性CTL反應(yīng)。賈雷立等［29］以流感病毒的主要抗原(NP、NA、M)表位的基因為基礎(chǔ)，設(shè)計并合成大小為765 bp的復(fù)合多表位基因盒，并克隆入真核表達(dá)載體，構(gòu)建的重組體對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫接種后，檢測體液與細(xì)胞免疫指標(biāo)，具有良好的免疫原性。彭金美等［30］以H5N1亞型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位為基礎(chǔ)構(gòu)建了4個重組質(zhì)粒，分別肌注免疫30日齡SPF雞，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并在同型禽流感強(qiáng)毒攻擊時對雞提供了一定的保護(hù)。Shi－gui Yang等［31］構(gòu)建的表位疫苗重組體VPR－VP22/HA和VPR－HA都具有良好的免疫效果，有望成為預(yù)防禽流感的表位疫苗。

4 表位疫苗研究的展望

通過眾多研究學(xué)者們對禽流感表位疫苗的研究，筆者認(rèn)為設(shè)計、研究由禽流感病毒多種抗原表位組成的多表位疫苗則能更有效的預(yù)防各種亞型禽流感的暴發(fā)?？乖砦皇菣C(jī)體免疫系統(tǒng)識別抗原的主要化學(xué)基團(tuán)，其氨基酸序列較短。抗原表位既能夠有效地被免疫系統(tǒng)識別、遞呈，又能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫。而且可通過選擇多個具有交叉保護(hù)性的抗原表位來預(yù)防多種亞型禽流感病毒毒株。同時較短的序列很容易合成，對載體的克隆能力要求較低，易于在載體中插人多個表位構(gòu)建基因工程多表位疫苗。因此表位疫苗作為一種新型的抗禽流感疫苗，具有很好的發(fā)展前景。

［1］Chen H，Smith G J，Zhang S Y，et al.Avian Flu:H5N1 Virus Outbreak in Migratory Waterfowl［J］.Nature，2005，436(7048):191－192.

［2］甘孟侯.禽流感［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:1－10.

［3］Abdel－ Ghafar AN，Chotpitayasunondh T，Gao Z，et al.Update on Avian Influenza A(H5N1)Virus Infection in Humans［J］.N Engl J Med，2008，358:261 －273.

［4］Webby R J，Webster R G.Are We Ready for Pandemic Influenza［J］.Science，2003，302(5650):1519 － 1522.

［5］Chang － Won Lee，Yehia M Saif.Avian Influenza Virus［J］.Comparative Immunology，Microbiology and Infectious Diseases，2009，32:301 －310.

［6］Maines T R，Lu X H，Erb S M，et al.Avian Influenza(H5N1)Viruses Isolated from Humans in Asia in 2004 Exhibit Increased Virulence in Mammals［J］.J Virol，2005，79(18):11788 －11800.

［7］Lee C W，Suarez D L.Avian Influenza Virus:Prospects for Prevention and Control by Vaccination［J］.Anim Health Res Rev，2005，6(1):1 －15.

［8］Smith D J.Predictability and Preparedness in Influenza Control［J］.Science，2006，312(5772):392 － 394.

［9］Subbarao K，Joseph T.Scientific Barriers to Developing Vaccines against Avian Influenza Viruses［J］.Nat Rev Immunol，2007，7(4):267－278.

［10］Gambotto A，Barratt－ Boyes S M，de Jong，et al.2008 Human Infection with Highly Pathogenic H5N1 Influenza Virus［J］.Lancet，2007，371(9622):1464 －1475.

［11］Cinatl J，Michaelis M，Doerr H W.The Threat of Avian Influenza A(H5N1)Part IV:Development of Vaccines［J］.Med Microbiol Immunol，2008，196(4):213 －225.

［12］宋建領(lǐng)，張文東，張富強(qiáng)，等.禽流感病毒M1蛋白型特異性表位分析［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2008，24(7):626 －630.

［13］王國戧，羅 予，陳三敏.禽流感病毒(H5N1型)血凝素(HA)T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測［J］.中國免疫學(xué)雜志，2008，24(8):742 －743.

［14］白 靚，金寧一，成 巖，等.H7N7亞型禽流感病毒血凝素B細(xì)胞和Th細(xì)胞表位預(yù)測及初步鑒定［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26(4):11－14.

［15］王開艷，李太元，魯會軍.HIN1亞型流感病毒血凝素Th和B細(xì)胞表位預(yù)測及抗原性分析［J］.中國免疫學(xué)雜志，2010，26(1):8－12.

［16］梁 瑾，王靖飛，吳春艷，等.異源抗體對接方法預(yù)測流感病毒血凝素B細(xì)胞構(gòu)象表位［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32(1):1－4.

［17］李 新，陳紅英，閆若潛，等.禽流感病毒T細(xì)胞表位與體外重建雞MHC I類分子結(jié)合試驗［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2007，38(12):1335－1340.

［18］Luke C J，Subbarao K.Vaccines for Pandemic Influenza［J］.Emerg Infect Dis，2006，12:66 －72.

［19］Chen Y X，Luo H F，Ge S X，et al.Development and Characteriation of MAb against Haemagglutinin of Highly Pathogenic H5 avian Influenza Virus［J］.Chinese Journal of Virology，2005，21(6):421－427.

［20］宋慧娟，羅文新，鄭振華，等.高致病性禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和表位模擬肽的篩選與鑒定［J］.病毒學(xué)報，2008，24(6):421－426.

［21］Chengjun Li，Jihui Ping，Bo Jing，et al.H5N1 Influenza Marker Vaccine for Serological Differentiation between Vaccinated and Infected Chickens［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，372:293 －297.

［22］Guus F.Rimmelzwaan，Joost H.C.M，Kreijtz，et al.Influenza Virus CTL Epitopes Remarkably Conserved and Remarkably Variable［J］.Vaccine，2009，27:6363 －6365.

［23］鄧路瑤，趙梓名，楊春光，等.禽流感抗原表位在沙門氏菌菌毛的表達(dá)［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，7(9):1290 －1293.

［24］R Bodewes，M M Geelhoed － Mieras，N J Nieuwkoop，et al.Redundancy of the Influenza A Virus－specific Cytotoxic T Lymphocyte Response in HLA－B*2705 Transgenic Mice Limits the Impact of a Mutation in the Immunodominant NP383－391 Epitope on Influenza Pathogenesis［J］.Virus Research，2011，155:123－130.

［25］Thomson S A，SherrittM A，Medveczky J，et al.Delivery of Multiple CD8 Eytotoxie T Cell Epitopes by DNA Vaccination［J］.J lmmunol，1998，160(4):1717 －1723.

［26］Pushko P，Tumpey T M，F(xiàn)ang B，et al.Influenza Virus－ like Particles Comprised of the HA，NA，and M1 Proteins of H9N2 Influenza Virus Induce Protective Immune Responses in BALB/c Mice［J］.Vaccine，2005，23(50):5751 – 5759.

［27］陳義鋒，金寧一，賈雷立.H3、H5、H7、H9亞型流感病毒通用多表位核酸疫苗構(gòu)建及表達(dá)研究［J］.中華微生物和免疫學(xué)雜志，2007，27(12):1136 －1138.

［28］李新生，陳紅英，高鳳山，等.體外鑒定的禽流感病毒T細(xì)胞表位的免疫效果研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39(4):460 －465.

［29］賈雷立，金寧一，魯會軍，等.流感復(fù)合多表位疫苗的設(shè)計及小鼠免疫研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2006，25(增刊)209 －210.

［30］彭金美，童光志，王云峰，等.抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效力研究［J］.生物工程學(xué)報，2003，l9(5):623－627.

［31］Shi－ gui Yang，Jian － er Wo，Min － wei Li.Construction and Cellular Immune Response Induction of HA－based Alpha Virus Replicon Vaccines against Human－avian Influenza(H5N1)［J］.Vaccine，2009，27:7451 －7458.