劉英杰,潘艷艷,李 瑩,馮 輝,劉 軍,曹雅明

2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110001

瘧疾流行主要由惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)感染所致,但兩個(gè)蟲(chóng)種的毒力存在明顯差異,其中前者毒力較強(qiáng),是導(dǎo)致重癥瘧疾發(fā)生的主要蟲(chóng)種。瘧疾再感染的發(fā)生在流行區(qū)普遍存在,但惡性瘧再感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著高于間日瘧[1],表明原蟲(chóng)毒力差異與再感染的免疫保護(hù)存在密切相關(guān)性。細(xì)胞免疫應(yīng)答是抵御胞內(nèi)寄生病原體再感染的主要因素[2],然而毒力不同的瘧原蟲(chóng)感染早期根治性治療后,宿主在再感染過(guò)程中細(xì)胞免疫應(yīng)答是否存在差異,目前尚未見(jiàn)明確報(bào)道。

致死型約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium yoelii17XL,Py17XL)和非致死型約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium yoelii17XNL,Py17XNL)分別與惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)具有相似的生物學(xué)特性[3]。為此,我們對(duì)Py17XL和Py17XNL感染早期DBA/2小鼠進(jìn)行根治性治療,然后用同種瘧原蟲(chóng)進(jìn)行再感染,通過(guò)對(duì)再感染前后細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度的檢測(cè),探討了毒力不同瘧原蟲(chóng)感染早期的根治性治療對(duì)再感染細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠、瘧原蟲(chóng)和實(shí)驗(yàn)感染 雌性,6～8 w齡DBA/2小鼠,分別經(jīng)腹腔接種1×106Py17XL和Py17XNL寄生的紅細(xì)胞。尾靜脈采血,吉姆薩薄血膜染色法計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.2 藥物治療和小鼠再感染 初次感染后3 d,經(jīng)口給藥(氯喹90 mg/kg,青蒿琥脂片60 mg/kg),每天一次,連續(xù)3 d。待初次感染后90 d,小鼠用同種瘧原蟲(chóng)再次攻擊感染。

1.3 脾細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌取出再感染前(0 d)和再感染后第1、3、5 d小鼠脾臟,常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液,調(diào)脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL,于24孔培養(yǎng)板上加入細(xì)胞懸液,500 μ L/孔,一式 3 組 ,培養(yǎng) 48 h,收集上清,-80℃保存,待細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.4 脾T細(xì)胞中活化性T細(xì)胞百分率的檢測(cè) 在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 mL,再加入抗CD4-FITC和抗CD69-PE mAb進(jìn)行表面染色,洗滌兩次并懸于500 μ L PBS中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞因子檢測(cè) 用ELISA試劑盒按說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10的含量進(jìn)行檢測(cè),酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值。以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算細(xì)胞因子含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,Student′s-t檢驗(yàn)比較各組均值的顯著性差異,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(結(jié)果為3次結(jié)果的均值)。

2 結(jié) 果

2.1 再感染后不同時(shí)間的原蟲(chóng)血癥水平 如圖1所示,兩組感染早期根治性治療小鼠在再感染過(guò)程中均出現(xiàn)了短暫的低水平蟲(chóng)體血癥。在再感染后每一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),不同毒力蟲(chóng)株感染鼠的蟲(chóng)體血癥水平基本相似,并均于攻擊后第6 d左右自愈;而未治療初次感染小鼠的蟲(chóng)體血癥水平持續(xù)升高,表明毒力不同瘧原蟲(chóng)初次感染早期根治性治療的小鼠對(duì)同種瘧原蟲(chóng)的再感染具有相似的抵抗力。

圖1 Py17XL和Py17XNL初次感染和再感染后的蟲(chóng)體血癥水平Fig.1 The levels of parasitemia after primary infection and reinfection with Py17XL and Py17XNL

2.2 再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)脾T細(xì)胞中活化性T細(xì)胞的百分率 如圖2所示,與正常或再感染前小鼠相比,再感染后第1 d兩組小鼠脾T細(xì)胞中活化性T細(xì)胞百分率均明顯增加,表明再感染前小鼠體內(nèi)存在一定數(shù)量的記憶性T細(xì)胞,當(dāng)再次感染時(shí)這些細(xì)胞迅速活化。而此后其進(jìn)一步升高,則提示除記憶性T細(xì)胞活化外,可能又有一些初始T細(xì)胞逐漸活化。但在每一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),不同毒力蟲(chóng)株感染鼠活化性T細(xì)胞的百分率基本相似。

2.3 再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子水平 如圖3所示,與正?；蛟俑腥厩靶∈笙啾?再感染后第1 d兩組小鼠的IFN-γ水平均出現(xiàn)了有意義的升高,并于第3 d達(dá)到峰值水平;與此同時(shí),TNF-α也開(kāi)始顯著升高。在每一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),不同毒力蟲(chóng)株感染鼠間的IFN-γ和TNF-α水平?jīng)]有顯著差異。

2.4 再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th2型細(xì)胞因子水平 如圖4所示,與正常或再感染前小鼠相比,兩組小鼠的IL-4和IL-10分別在再感染后第5 d和3 d出現(xiàn)了有意義的升高。盡管IL-10在再感染后第5 d出現(xiàn)一定程度的下降,但在每一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),不同毒力蟲(chóng)株感染鼠間的IL-4和IL-10水平并沒(méi)有顯著差異。

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示,惡性瘧再感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高于間日瘧[1],盡管惡性瘧再感染后的蟲(chóng)荷水平有所下降,但多數(shù)感染者仍具有較高的蟲(chóng)荷水平,并有明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)[4],而間日瘧再感染后的蟲(chóng)荷水平較低,且沒(méi)有明顯的臨床癥狀[5]。有研究證實(shí),CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抵御瘧疾再感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6],間日瘧感染者痊愈后一年左右,其外周血中淋巴細(xì)胞可對(duì)間日瘧原蟲(chóng)抗原產(chǎn)生明顯的應(yīng)答反應(yīng)(分泌高水平IFN-γ),但惡性瘧感染者卻未能產(chǎn)生此應(yīng)答反應(yīng)[7]。這些結(jié)果充分提示,再感染的T細(xì)胞應(yīng)答水平與原蟲(chóng)毒力差異存在密切相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同毒力蟲(chóng)株感染鼠早期根治性治療后對(duì)同種瘧原蟲(chóng)再感染具有相似的抵抗力;其再感染后均可迅速建立以IFN-γ分泌升高為主的高強(qiáng)度Th1應(yīng)答,而后又產(chǎn)生了適度的以IL-4和IL-10升高為主的Th2應(yīng)答,并且在每一相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),不同毒力蟲(chóng)株感染鼠間無(wú)論是蟲(chóng)體血癥水平還是活化性T百分率以及Th1和Th2細(xì)胞因子水平均未出現(xiàn)顯著差異。有研究證明,強(qiáng)毒株瘧原蟲(chóng)感染可損傷或破壞宿主的免疫器官,進(jìn)而產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)[3];抗原劑量可改變宿主的免疫應(yīng)答類型和強(qiáng)度[8-9]。據(jù)此我們認(rèn)為,當(dāng) Py17XL和Py17XNL感染的紅細(xì)胞在外周血出現(xiàn)時(shí)即進(jìn)行根治性治療可使小鼠受到相同的蟲(chóng)荷抗原刺激,同時(shí)也抑制了強(qiáng)毒株P(guān)y17XL對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的破壞作用,因此兩組小鼠在再感染時(shí)獲得了相似的免疫保護(hù)。

綜上所述,不同毒力瘧原蟲(chóng)感染早期根治性治療后,宿主在同種瘧原蟲(chóng)再感染時(shí)可產(chǎn)生模式和強(qiáng)度相似的細(xì)胞免疫應(yīng)答,強(qiáng)毒株原蟲(chóng)感染也能獲得與弱毒株相同的可抵御再感染的能力。

[1]Michon P,Cole-Tobian JL,Dabod E,et al.T he risk of malarial infections and disease in Papua New Guinean children[J].Am J Trop Med Hyg,2007,76(6)：997-1008.

[2]Grakoui A,Shoukry NH,Woollard DJ,et al.HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help[J].Science,2003,302(5645)：659-662.

[3]Schaecher K,Kumar S,Yadava A,et al.Genome-wide expression profiling in malaria infection reveals transcriptional changes associated with lethal and nonlethal outcomes[J].Infect Immun,2005,73(9)：6091-6100.

[4]Collins WE,Jeffery GM.A retrospective examination of secondary sporozoite-and trophozoite-induced infections withPlasmodium f alciparum：development of parasitologic and clinical immunity following secondary infection[J].Am J Trop Med Hyg,1999,61(1 Suppl)：20-35.

[5]Collins WE,Jeffery GM,Roberts JM.A retrospective examination of reinfection of humans withPlasmodium vivax[J].Am J Trop Med Hyg,2004,70(6)：642-644.

[6]Praba-Egge AD,Montenegro S,Cogswell FB,et al.Cy tokine responses during acute simianPlasmodium cy nomolgiandPlasmodium knowlesiinfections[J].Am J T rop Med Hyg,2002,67(6)：586-596.

[7]Zevering Y,Khamboonruang C,Rung ruengthanakit K,et al.Life-spans of human T-cell responses to determinants from the circumsporozoite proteins ofPlasmodium f alciparumandPlasmodium vivax[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(13)：6118-6122.

[8]Pombo DJ,Lawrence G,Hirunpetcharat C,et al.Immunity to malaria after administration of ultra-low doses of red cells infected withPlasmodiumf alciparum[J].Lancet,2002,360(9333)：610-617.

[9]Freitas do Rosário AP,Muxel SM,Rodr í guez-M á laga SM,et al.Gradual decline in malaria-specific memory T cell responses leads to failure to maintain long-term protective immunity toPlasmodium chabaudi ASdespite persistence of B cell memory and circulating antibody[J].J Immunol,2008,181(12)：8344-8355.