趙澤赟,劉淑英,羅學(xué)東

綿羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)是引起綿羊肺腺瘤病(sheep pulmonary adenomatosis SPA)的病原,該病毒主要侵害肺臟[1]。SPA是一種慢性、進(jìn)行性、接觸傳染性的肺臟腫瘤性疾病。該病主要以患羊咳嗽、呼吸困難、消瘦、大量漿液性鼻液、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和無(wú)纖毛細(xì)支氣管上皮細(xì)胞腫瘤性增生為特征[2-3]。綿羊肺腺瘤病1825年首先發(fā)現(xiàn)于南非,目前,幾乎所有養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū),包括我國(guó)的新疆、內(nèi)蒙、青海等省區(qū)都有該病的發(fā)生和流行,嚴(yán)重制約和影響著世界養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展[4]。此外,SPA與人類細(xì)支氣管—肺泡癌(bronchiolo-alveolar carcinoma,BAC)在臨床癥狀、病理組織學(xué)特征及超微病變方面極為相似,研究SPA病羊可作為研究人類BAC的理想動(dòng)物模型[1]。綿羊肺腺瘤病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒科β-反轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員之一,很多研究表明健康綿羊基因組中含有至少20拷貝與exJSRV相似內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(endogenous jaagsiekte sheep retrovirus,enJSRV)序列,并且exJSRV和enJSRV在結(jié)構(gòu)和序列上同源性很高[5],在絕大多數(shù)區(qū)域同源性高達(dá)98%以上,但有 3個(gè)高可變區(qū),分別位于 U3、env、gag區(qū)[6-7]。目前,因?yàn)樵摬≡谘褐袡z測(cè)不到循環(huán)抗體,所以不能用常規(guī)的血清學(xué)診斷方法,我國(guó)對(duì)本病一般通過(guò)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理組織學(xué)切片進(jìn)行粗略的診斷,尚無(wú)快速、特異、靈敏的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

本試驗(yàn)在高可變區(qū)env基因的TM區(qū)和LTR的U3區(qū)分別設(shè)計(jì)了2套引物,采用巢式 RT-PCR技術(shù)對(duì)引起綿羊肺腺瘤病(SPA)的病原進(jìn)行進(jìn)一步的確診,為建立特異性診斷該病的方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及處理 樣品來(lái)源于內(nèi)蒙古呼和浩特市某種羊場(chǎng)自然感染JSRV的病例,經(jīng)過(guò)病理解剖、病理組織切片觀察,初步診斷為綿羊肺腺瘤病,取該病羊的肺臟、腎臟、肝臟、脾臟,小鼠、家兔的肺臟分別放在無(wú)RNase凍存管中于-80℃保存。取健康綿羊肺臟(陰性對(duì)照),放在無(wú) RNase凍存管中于-80℃保存。

1.2 常用試劑 總RNA提取試劑盒,反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒,Ex Taq DNA聚合酶,dNTP Mixture,Marker DL2000膠回收試劑盒,均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 總RNA的提取 按照總RNA提取試劑盒的說(shuō)明分別提取病羊肺臟的總RNA,獲得的總RNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定,并用微量紫外分光光度計(jì)(型號(hào):ND-1000NanoDrop美國(guó)出產(chǎn))檢測(cè)RNA的濃度和純度,之后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì) 由于enJSRV與exJSRV序列的差異主要存在于LTR的 U3區(qū)及env基因的編碼跨膜蛋白的 TM區(qū),于是根據(jù)GenBank中注冊(cè)的JSRV基因全序列(登錄號(hào)為AF105220),用 Primer 5.0軟件在 LT R的 U3區(qū)及囊膜基因(env)的TM區(qū)分別設(shè)計(jì)套式引物,env基因的外側(cè)上游引物P1和下游引物P2,預(yù)計(jì)其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為924 bp(P1,P2分別位于AF105220的6228-6247和7151-7195位點(diǎn));內(nèi)側(cè)上游引物P3和下游引物 P4,預(yù)計(jì)其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為730 bp(P3,P4分別位于AF105220的6339-6357和7068-7083位點(diǎn))。LTR的U3區(qū)的外側(cè)上游引物N1和外側(cè)下游引物N2,預(yù)計(jì)其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為354 bp(N1,N2分別位于AF105220的7046-7063和7399-7419位點(diǎn));內(nèi)側(cè)上游引物 N3和下游引物N4,預(yù)計(jì)其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為161bp(N3,N4分別位于AF105220的7239-7259和7399-7419位點(diǎn))。引物由大連寶生物工程有限公司合成。各引物的序列分別為:

1.5 巢式RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反轉(zhuǎn)錄體系為:采用10 μL體系,在 PCR管中依次加入 5×PrimeScript Buffer 2μL,Oligo dT Primer(25pm/μL)0.5μL,Random 6 mers(50pm/μL)0.5μL,PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL,模板 RNA 1μL,其余用超純水補(bǔ)至10μL。反轉(zhuǎn)錄條件為:37℃15min,85℃5 s。

外側(cè) PCR反應(yīng)體系為:反應(yīng)總體系為50μL,在PCR管中依次加入 Ex Taq酶(5 U/μL)0.25μL,10×Buffer(含 Mg離子)5μL,dNTP(各 215 mmol/L)4μL,反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 模板 2μL,20 pmol/μL 的上下游引物 P1,P2;N1,N2;各 1μL,其余用超純水補(bǔ)至 50μL。在1%瓊脂糖凝膠中電泳,用凝膠成像系統(tǒng)拍照,觀察結(jié)果。

內(nèi)側(cè)PCR反應(yīng)體系同外側(cè)PCR反應(yīng)體系。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,env基因外側(cè)52℃退火30 s,內(nèi)側(cè)52℃退火30 s,LTR的U3區(qū)外側(cè)52℃退火30 s,內(nèi)側(cè)52℃退火30 s,72℃延伸1 min,env基因進(jìn)行35個(gè)循環(huán),LTR的U3區(qū)進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后于72℃延伸10 min。反應(yīng)后,PCR產(chǎn)物取5μL,在 1%瓊脂糖凝膠中電泳,用凝膠成像系統(tǒng)拍照,觀察結(jié)果。

1.6 巢式RT-PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序及序列同源性比較 用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒分別回收env基因和 LTR的U3區(qū)的巢式RT-PCR產(chǎn)物。送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行雙向序列測(cè)定,應(yīng)用DNAstar軟件對(duì)測(cè)得的序列與已經(jīng)登錄enJSRV和exJSRV序列進(jìn)行比較。

1.7 特異性試驗(yàn) 采用相同的引物和反應(yīng)條件,提取感染JSRV的病羊腎臟、肝臟、脾臟的 RNA為模板,進(jìn)行巢式RT-PCR的特異性試驗(yàn),用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè);再取健康綿羊、小鼠、家兔的肺臟分別提取RNA進(jìn)行巢式 RTPCR的特異性試驗(yàn),用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 敏感性試驗(yàn) 取陽(yáng)性病料的肺組織,提取RNA,測(cè)定其濃度及A260/A280的值,按10倍連續(xù)進(jìn)行稀釋,進(jìn)行巢式RT-PCR擴(kuò)增,檢測(cè)其敏感性。

1.9 與普通RT-PCR進(jìn)行比較 應(yīng)用特異性引物 P1/P2以及N1/N2,在篩選出最適反應(yīng)條件下,采用50μL反應(yīng)體系,在 PCR 管中依次加入 Ex Taq酶(5 U/μL)0.25μL,10×Buffer(含 Mg離子)5μL,dNTP(各215 mmol/L)4μL,反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板 2μL,20 pmol/μL的上下游引物 P1,P2;N1,N2;各 1μL,其余用超 純水補(bǔ)至 50μL。

循環(huán)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,env基因52℃退火30 s,LTR的U3區(qū)52℃退火30 s,72℃延伸1 min,env基因進(jìn)行35個(gè)循環(huán),LT R的U3區(qū)進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后于72℃延伸10 min。將模板RNA進(jìn)行梯度稀釋,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,其結(jié)果與巢式RT-PCR進(jìn)行比較。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 用外側(cè)引物P1/P2,N1/N2以及內(nèi)側(cè)引物P3/P4,N3/N4進(jìn)行巢式RT-PCR反應(yīng),使用陽(yáng)性病料的總RNA為模板,進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),來(lái)確定試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2 結(jié) 果

2.1 巢式RT-PCR擴(kuò)增 以陽(yáng)性病料的肺組織提取的總RNA為模板,以env基因的外側(cè)引物P1/P2,以及LT R的U3區(qū)的外側(cè)引物N1/N2,分別進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增,同時(shí)設(shè)置健康綿羊肺組織總RNA以及水為模板的陰性對(duì)照。env基因外側(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳顯示約為924 bp,LT R的U3區(qū)外側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物顯示約為354 bp(如圖1)。

以外側(cè)產(chǎn)物為模板,用內(nèi)側(cè)引物P3/P4,N3/N4分別進(jìn)行的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳顯示env基因的片段約為730 bp,LTR的U3區(qū)的片段約為161 bp(如圖2)。

圖1 env基因、LTR的U3區(qū)外側(cè)引物的擴(kuò)增結(jié)果與陰性對(duì)照Fig.1 RT-PCR products of env gene and U3(using outer primers P1P2,N1N2 separately)and negative control

2.2 序列同源性分析 經(jīng)過(guò)大連寶生物工程有限公司對(duì)巢式RT-PCR產(chǎn)物純化,進(jìn)行雙向測(cè)序,將2個(gè)基因的測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAstar軟件與GenBank中已登錄的外源性exJSRV序列(AF105220),內(nèi)源性enJSRV序列(AF153615)進(jìn)行比較分析,其中測(cè)得的env基因序列與外源性exJSRV的核苷酸同源性達(dá)100%,與內(nèi)源性enJSRV核苷酸的同源性為88%,說(shuō)明擴(kuò)增到的目的序列為外源性的病毒序列;LTR的U3區(qū)序列與外源性exJSRV的核苷酸同源性達(dá)98%,與內(nèi)源性 enJSRV核苷酸的同源性為48%,說(shuō)明擴(kuò)增到的目的序列也為外源性的病毒序列。

圖2 env基因、LTR的U3區(qū)巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Nested PCR products of env gene(using inner primers P3P4,outer RT-PCR product of env gene as templates)and U3(using inner primers N3N4,outer RT-PCR product of U3 as templates)

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 用感染JSRV的病羊腎臟、肝臟、脾臟的RNA為模板,在相同的條件下用env基因和LTR的U3區(qū)的引物進(jìn)行巢式 RT-PCR試驗(yàn),用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均未見到相應(yīng)的條帶(如圖3);用健康綿羊、小鼠、家兔的肺臟分別提取RNA,在相同條件下進(jìn)行巢式RT-PCR試驗(yàn),用瓊脂糖凝膠電泳也均未見到相應(yīng)條帶(如圖4),證明了不論是同一病羊的不同組織,還是不同動(dòng)物的同一組織,本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物是特異的。

圖3 同一感染SPA羊env gene、LTR的U3區(qū)特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity result of env gene and U3 by nested RT-PCR

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 用微量紫外分光廣度計(jì)測(cè)定,A260/A280=2.0134,可用于 RT-PCR擴(kuò)增。取標(biāo)準(zhǔn)品總 RNA(含量480.4 ng/μL)按10倍倍比稀釋后,用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)env基因和LT R的U3區(qū)的引物進(jìn)行巢式RT-PCR方法檢測(cè)。該反應(yīng)體系檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)模板RNA的最大稀釋倍數(shù)為1×109,即env基因最低可檢測(cè)到約為48 fg的RNA,結(jié)果如圖5所示;LTR的 U3區(qū)最低可檢測(cè)到約為 48 pg的RNA,結(jié)果如圖6所示。

2.5 普通RT-PCR敏感性試驗(yàn)及與巢式RT-PCR敏感性的比較 取標(biāo)準(zhǔn)品總RNA(含量480.4 ng/μL)按10倍倍比稀釋后,用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的env基因和LTR的U3區(qū)的外側(cè)引物進(jìn)行普通 RT-PCR方法的檢測(cè)。該反應(yīng)體系檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)模板RNA的最大稀釋倍數(shù)為1×109,即env基因最低可檢測(cè)到約為0.48 ng的RNA,結(jié)果如圖7所示;LT R的 U3區(qū)最低可檢測(cè)到約為4.8 ng的 RNA,結(jié)果如圖8所示。說(shuō)明巢式RT-PCR比普通RT-PCR更靈敏,且env基因的敏感性高于LTR的U3區(qū)。

圖7 env基因普通RT-PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Sensitivity result of env gene by RT-PCR

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 用陽(yáng)性病料的總RNA為模板,用內(nèi)外側(cè)引物進(jìn)行巢式RT-PCR擴(kuò)增,重復(fù)3次,并同時(shí)也用健康綿羊肺臟的RNA為模板,進(jìn)行同樣擴(kuò)增,作為陰性對(duì)照,陽(yáng)性病料每次都能出現(xiàn)特異性條帶,而陰性對(duì)照則未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶,說(shuō)明本試驗(yàn)具有高度穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖8 LTR的U3區(qū)普通RT-PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Sensitivity result of U3 by RT-PCR

3 討論

到目前為止,在 SPA病羊體內(nèi)未曾檢測(cè)到exJSRV的循環(huán)抗體,因此,不能用常規(guī)的免疫學(xué)方法進(jìn)行診斷。另外,exJSRV還無(wú)法在體外培養(yǎng)傳代,所以常規(guī)的病毒分離鑒定方法在SPA診斷中也無(wú)法利用。目前,SPA的診斷主要依靠臨床癥狀和病理組織學(xué)檢查,但特異性的診斷還需依靠分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行確診,所以本研究運(yùn)用了巢式 RTPCR的方法,對(duì)SPA的病原進(jìn)行檢測(cè)。

Bai等對(duì)來(lái)自美國(guó) 3個(gè)州的 6個(gè)enJSRV和exJSRV病毒分離株進(jìn)行對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)gag基因、LTR、env基因是內(nèi)源性enJSRV和外源性exJSRV之間的可變區(qū),尤其是env基因編碼跨膜蛋白區(qū)域(TM)和LTR的U3區(qū)是2個(gè)高可變區(qū)[8]。Palmarini等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性enJSRV env和外源性exJSRV env基因的同源性為89%,但在env基因編碼跨膜蛋白區(qū)域(TM)和 LT R的U3區(qū),同源性分別為57%～59%、50%[9]。因此本研究分別在env基因的TM區(qū)和LT R的U3區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,從而來(lái)保證診斷的特異性。本試驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用病肺組織提取的RNA為模板進(jìn)行的巢式RT-PCR,在env基因(730 bp)和LTR的U3區(qū)(161 bp)上都成功的擴(kuò)增出了外源性exJSRV的特異性基因序列,序列分析所擴(kuò)增的片段與外源性exJSRV的同源性分別高達(dá)100%和98%。

本課題組的梁化春等在進(jìn)行該病的診斷時(shí),運(yùn)用了RT-PCR技術(shù)和半巢式RT-PCR技術(shù)成功的擴(kuò)增出了外源性exJSRV的3段特異性基因序列(U3、env基因、gag基因),擴(kuò)增序列的同源性和外源性exJSRV基因序列的同源性也較高,最后確診病例為綿羊肺腺瘤病[10]。然而他們的試驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行敏感性的試驗(yàn),沒(méi)有確定半巢式的方法的最低病毒檢出量是多少。

本研究通過(guò)提取病羊肺臟總RNA運(yùn)用在env基因和LTR的U3區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行巢式RT-PCR和普通 RT-PCR,并且對(duì)比普通特異性RT-PCR和巢式RT-PCR的敏感性。env基因的巢式RT-PCR診斷方法最低能檢測(cè)出48 fg的標(biāo)準(zhǔn)模板RNA,LTR的 U3區(qū)的巢式 RT-PCR診斷方法最低能檢測(cè)出48 pg的標(biāo)準(zhǔn)模板 RNA,而普通的RT-PCR,env基因及LTR的 U3區(qū)的最低檢出量分別為0.48 ng和4.8 ng,試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明巢式RTPCR的敏感性明顯高于特異性RT-PCR的敏感性,同時(shí)還得出env基因的敏感性明顯高于LTR的U3區(qū)的敏感性。所以在相同的條件下用env基因進(jìn)行檢測(cè)比LTR的U3區(qū)檢測(cè)的敏感性更高,所以在診斷時(shí)利用env基因可能要更好。

目前,對(duì)于綿羊肺腺瘤病的診斷還沒(méi)有快速、高效的方法,而且Marcel D等報(bào)道約240 000個(gè)外周血單核細(xì)胞中只含有一拷貝的外源性前病毒序列[11],由于病毒載量極低,所以用普通RT-PCR方法很難檢測(cè)到或容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,制約了該病的檢測(cè)研究,本試驗(yàn)采用敏感性很高的巢式RT-PCR技術(shù),通過(guò)對(duì)比env基因和LT R的U3區(qū)的敏感性,得出env基因在檢測(cè)中的敏感性更高,所以在實(shí)踐中,應(yīng)用env基因引物通過(guò)巢式RT-PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)SPA將成為檢測(cè)該病的有效方法。

[1]Palmarini M,Fan H.Retrovirus-Induced ovine pulmonary adenocarcinoma,an animal model for lung cancer[J].Journal of the National Cancer Institute,2001,93:1603-1614.

[2]Palmarini M,Delasheras M,Lnglis NF,et al.Epithelial tumour cells in the lungs of sheep with pulmonary adenomatosis are major sites of replication for Jaag siekte retrovirus[J].J Gen Virol,1995,76:2731-2737.

[3]Palmarini M,Dalziel RG,Bai J,et al.The exogenous form of Jaagsiekte retrovirus is specifically associated with a contagious lung cancer of sheep[J].J Virol,1996,70:1618-1623.

[4]Beytut E,Sozmen M,Erginsoy S.Immunohistochemical detection of pulmonary surfactant proteins and retroviral antigens in the lungs of sheep with pulmonary adenomatosis[J].Comp Pathol,2009,140(1):43-53.

[5]Bai J,Bishop JV,Carlson JO,et al.Sequence comparison of JSRV with endogenous proviruses:Envelope genotypes and a novel ORF with similarity to a G-protein-coupled receptor[J].Virology,1999,258:333-343.

[6]De Las Heras M,Ortin A,Salvatori D,et al.A PCR technique for the detection of Jaagsiekte sheep retrovirus in the blood suitable for the screening of ovine pulmonary adenocarcinoma in field conditions[J].Res Vet Sci,2005,79(3):259-64.

[7]劉淑英,馬學(xué)恩,齊景偉,等.綿羊肺腺瘤病毒NM 株前病毒基因組的克隆與全序列[J].中國(guó)病毒學(xué),2006,21(5):443-448.

[8]Bai J,Zhu RY,Stedman K,et al.Unique long terminal repeat U3 sequences distinguish exogenous jaag siekte sheep retroviruses associated with ovine pulmonary carcinoma from endogenous loci in the sheep genome[J].J Virol,1996,70(5):3159-3168.

[9]Palmarini M,Hallwirth C,York D,et al.M olecular cloning and functional analysis of three type D endogenous retrovirus of sheep reveal a different cell tropism from that of the highly related exogenous jaagsiekte sheep retrovirus[J].J Virol,2000,74(17):8065-8076.

[10]梁化春,齊景偉,劉淑英,等.綿羊肺腺瘤病的病理學(xué)及 RT-PCR診斷[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,31(6):443-447.

[11]Marcel D,Aurora O,Daniela S,et al.A PCR technique for the detection of Jaagsiekte sheep retrovirus in the blood suitable for the screening of ovine pulmonary adenocarcinoma in field conditions[J].Research in Res Vet Sci,2005,79(3):259-264.