王 靜,盧志紅,董尚林,劉開揚

新城疫病毒(Newcastle diease virus,NDV)屬禽類副黏病毒科副黏病毒亞科腮腺炎病毒屬,NDV的基因組為單股負鏈RNA,大小約為15～16 kb,包括6種基因,分別用于編碼6種病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。NDV按其毒力大小可分為強毒株、中等毒力毒株和弱毒株,NDV強毒株是禽類高度感染的致死性病毒,偶爾感染人類,表現(xiàn)為輕微的流感樣癥狀或結(jié)膜炎,一般無需治療,一周左右可自愈。NDV弱毒株能選擇性殺傷人和動物的多種腫瘤細胞[1],具有潛在的治療多種腫瘤的作用,對人無致病力,因此,被廣泛應(yīng)用于各種抗腫瘤研究中。研究證明NDV的抗腫瘤機制有以下幾個方面:誘導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生;對免疫細胞的調(diào)節(jié)作用;其 HN蛋白的抗腫瘤作用以及對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用。本文重點對NDV誘導(dǎo)宿主細胞分泌的細胞因子及其作用進行綜述。

細胞因子是機體抗腫瘤機制的重要組成部分,可在很大程度上改善腫瘤的微環(huán)境,在局部可增強特異性 T細胞對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答,增強N K細胞的殺傷活性[2-3]。NDV具有很強的非特異性免疫刺激作用,感染后能夠活化宿主細胞,在細胞表面誘導(dǎo)產(chǎn)生白細胞介素(Interleukin,IL)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、干擾素 (Interferon,IFN)、集落刺激因子(Colony Stimulating Factor,CSF)、一氧化氮等細胞因子和局部趨化因子,這些細胞因子均有直接或間接的抗腫瘤作用,可進一步增強NDV的抗腫瘤功能。

1 白細胞介素(Interleukin,IL)

白細胞介素可由淋巴細胞、單核細胞等多種細胞產(chǎn)生,在細胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)、造血及炎癥過程中發(fā)揮著重要作用,并且白細胞介素可以活化淋巴細胞和巨噬細胞,提高機體的免疫功能,從而殺傷腫瘤細胞。研究證明,NDV感染機體后可誘導(dǎo)機體免疫細胞產(chǎn)生的白細胞介素有 IL-1、IL-2、IL-6等,至于NDV感染是否可引起其他種類的白細胞介素的分泌則未見相關(guān)報道。

1.1 白細胞介素1 IL-1主要由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生,有IL-1α和 IL-1β兩種不同的分子形式。IL-1具有炎癥介質(zhì)的作用,對機體的免疫具有啟動、放大效應(yīng)和正向調(diào)節(jié)作用,對多種腫瘤細胞的生長具有抑制效應(yīng),與 IL-2或干擾素協(xié)同可以增強N K細胞活性。早在1997年就有學(xué)者[4]給小鼠腹腔接種NDV后,分別在接種后的1 h、2 h、4 h,用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測感染NDV小鼠脾臟內(nèi)細胞因子的mRNA,發(fā)現(xiàn)機體在感染NDV 2 h后即可出現(xiàn) IL-1α和 IL-1β的 mRNA,從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生 IL-1α和 IL-1β,即使使用滅活的NDV,依然可以檢測到 IL-1β的分泌。但是當時他們只證實了NDV感染后可以誘導(dǎo) IL-1的產(chǎn)生,至于產(chǎn)生的IL-1在NDV的抗腫瘤中究竟起到什么作用,其對腫瘤細胞有什么抑制作用,并未做更深入的研究。

1.2 白細胞介素2 IL-2是白介素家族中的重要成員之一、機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的核心物質(zhì),又被稱為T細胞生長因子(T cell growth factor,TCGF),主要由CD4+和CD8+T細胞產(chǎn)生,可以自分泌或旁分泌方式發(fā)揮效應(yīng)。IL-2可促進 T、B等免疫細胞的增殖分化,增強N K細胞的殺傷活性,誘導(dǎo)LA K細胞生成并促進其活化,另外,IL-2還可促進其他細胞因子如干擾素、腫瘤壞死因子等的分泌以及抗體的產(chǎn)生。此外,有研究發(fā)現(xiàn),IL-2可通過上調(diào)Fas受體及抑制Fas相關(guān)磷酸酶的表達而促進結(jié)腸癌細胞的凋亡[5]。NDV具有誘導(dǎo)生成 IL-2的作用[6],但是直接研究NDV誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-2發(fā)揮抗腫瘤作用的報道卻為數(shù)不多,對于 IL-2的研究,多數(shù)學(xué)者側(cè)重于導(dǎo)入外源性IL-2基因的重組NDV的抗腫瘤研究,并且取得了一定的進展。將人IL-2基因作為外源基因整合到NDV基因組中,用其感染腫瘤疫苗后,通過腫瘤中和試驗,發(fā)現(xiàn)可刺激 T細胞發(fā)揮抗腫瘤活性,此種效應(yīng)與不含 IL-2基因的NDV相比顯著增強,即NDV固有的免疫刺激作用可以通過引入治療性的 IL-2基因來進一步的增強[7]。Zamarin D等人[8]將鼠IL-2基因插入NDV基因組中的P基因和M基因之間,構(gòu)建了表達 IL-2的重組NDV(NDV(F3aa-IL-2)),給C57/BL6小鼠預(yù)防性皮下或靜脈接種NDV(F3aa株)、NDV(F3aa-IL-2),然后給各組小鼠皮下注射小鼠B16/F10黑色素瘤細胞,成瘤后,分別給荷瘤小鼠瘤內(nèi)注射 PBS、NDV(F3aa)、NDV(F3aa-IL-2),25 d后PBS組8只小鼠腫瘤顯著,NDV(F3aa)組13只小鼠僅有2只小鼠可見腫瘤,但瘤體積明顯小于 PBS組,NDV(F3aa-IL-2)組小鼠未檢測到腫瘤。此結(jié)果說明了與注射 PBS組和注射 NDV(F3aa)組相比,NDV(F3aa-IL-2)有明顯的抗小鼠惡性黑色素瘤作用。他們還觀察了NDV(F3aa-IL-2)長期的抗腫瘤效應(yīng),發(fā)現(xiàn)表達 IL-2的重組 NDV(NDV(F3aa-IL-2)),可顯著提高小鼠的總體生存率(與 PBS對照組相比P=0.0002,與 NDV(F3aa)組相比P=0.0498)。

1.3 白細胞介素6 IL-6是機體免疫網(wǎng)絡(luò)中最重要的細胞因子之一,主要由單核巨噬細胞分泌,部分來自于 T細胞、B細胞、成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞。在天然情況下,IL-6可以通過旁分泌和自分泌形式在局部發(fā)揮作用,但是在某些病理情況下,如急性炎癥時,也可通過內(nèi)分泌形式在全身發(fā)揮作用。IL-6有著非常復(fù)雜的生物學(xué)功能,可通過影響細胞的粘附性、活動力、血栓形成、腫瘤特異性抗原的表達及腫瘤細胞的增殖而影響腫瘤的進展[9]。IL-6對腫瘤的生長有雙向調(diào)節(jié)作用,可根據(jù)腫瘤細胞的類型及其表面是否有IL-6受體,表現(xiàn)為抑制或促進腫瘤細胞的增殖。對前列腺癌細胞,IL-6可通過激活JA K-STA T3信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)對其生長的抑制作用[10]。對頸部腫瘤IL-6可通過激活VEGF-A介導(dǎo)的血管新生促進其生長[11]。有研究證明了NDV可以誘導(dǎo)機體免疫細胞分泌 IL-6[4,12],那么,NDV誘導(dǎo)分泌的IL-6對腫瘤細胞究竟是抑制還是促進呢?有關(guān)此類研究的報道較少。張琪等人通過構(gòu)建S37腫瘤鼠模型,用 HE染色和免疫組化的方法對NDV治療腫瘤時瘤組織中IL-6的動態(tài)表達進行了研究,發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織壞死區(qū),IL-6表達很弱甚至不表達,而在生長旺盛的腫瘤組織,治療組IL-6表達呈強陽性。治療組 IL-6的表達隨著腫瘤組織的變化,呈現(xiàn)由陽性到強陽性再到陽性的變化,這表明了NDV在治療腫瘤的過程中,能促使機體產(chǎn)生大量的細胞因子參與機體的抑瘤作用,并且有可能參與了腫瘤細胞的壞死及凋亡過程[13]。

2 腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)

TNF具有抗炎、抗休克、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[14],TNF通過與靶細胞膜上的TNF受體結(jié)合后,可激發(fā)細胞內(nèi)的一系列信號傳遞,引起鈣離子濃度增加,激活核酸內(nèi)切酶,導(dǎo)致DNA降解、細胞凋亡。TNF抗腫瘤機制主要有對腫瘤細胞的直接毒性、對腫瘤血管結(jié)構(gòu)效應(yīng)及宿主抗腫瘤機制的激活等幾個方面。TNF有兩種類型 TNF-α和 TNF-β。TNF-α是由被激活的巨噬細胞產(chǎn)生的有多種活性的多肽類細胞因子,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強的生物因子,是宿主的重要防衛(wèi)機制之一[15-16],TNF-α的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、破壞腫瘤組織血管、放化療免疫增敏作用、介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用等。TNF-β又稱為淋巴毒素(lymphotoxin,L T),由活化的 T細胞和N K細胞產(chǎn)生,它與 TNF-α有結(jié)構(gòu)上的同源性和功能上的相似性,TNF-β能殺死某些腫瘤細胞或者抑制其增殖,其機制可能是直接殺傷或抑制腫瘤細胞、調(diào)節(jié)機體免疫功能、損傷內(nèi)皮細胞或?qū)е卵芄δ芪蓙y,造成腫瘤組織的局部血流阻斷而發(fā)生出血、缺氧壞死[17]。對于NDV誘導(dǎo) TNF-β分泌并發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的報道較少,大量文獻表明 NDV可以誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生并發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。Huang C等人[18]通過構(gòu)建人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型研究NDV D817毒株的抗腫瘤效應(yīng),采用NDV D817高、中、低三個劑量,觀察不同劑量NDV D817對移植瘤的抑制作用,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測荷瘤小鼠體內(nèi) TNF-α的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中劑量NDV D817可明顯抑制移植瘤的生長,抑制率達48.1%,NDV D817具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和誘導(dǎo)機體產(chǎn)生 TNF-α的作用。但是NDV D817誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是否與誘導(dǎo) TNF-α產(chǎn)生有關(guān),并未進一步研究。白蓮花等人用新城疫病毒L系(NDV-L)作用于小鼠腹腔巨噬細胞 PEMФ,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDVL可誘導(dǎo)小鼠 PEMФ產(chǎn)生 TNF-α,并且產(chǎn)生 TNF-α的量與NDV-L作用的時間和劑量有一定的關(guān)系,當NDV-L感染劑量一定時 TNF-α的釋放量在NDV-L作用24h時最強。用3H-脫氧胸苷(3HTdR)標記腫瘤細胞做 TNF-α的細胞毒實驗,表明其具有明顯的殺傷活性。將NDV-L處理的PEMФ靜脈轉(zhuǎn)輸給B16黑色素瘤荷瘤小鼠,發(fā)現(xiàn)對肺轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用(P<0.01)。此項研究說明了NDV-L可以誘導(dǎo)小鼠 PEMФ產(chǎn)生 TNF-α,并且產(chǎn)生的 TNF-α具有明顯的細胞毒作用,在體內(nèi)具有明顯的抑制肺轉(zhuǎn)移的作用[19-20]。NDV不僅可以誘導(dǎo)人單核細胞產(chǎn)生 TNF-α,并且其感染腫瘤細胞后能增強腫瘤細胞對 TNF-α溶細胞效應(yīng)的敏感性[21]。

3 干擾素(Interferon,IFN)

干擾素是一類具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[22]的細胞因子,也是最先被發(fā)現(xiàn)、最早被應(yīng)用于臨床的細胞因子。依據(jù)其來源、受體、應(yīng)答途徑和效應(yīng)的不同可分為Ⅰ型和Ⅱ型干擾素:IFN可以通過促進機體免疫細胞功能,提高巨噬細胞、N K細胞以及細胞毒性 T淋巴細胞(CTL)的殺傷能力來發(fā)揮其抗腫瘤作用。NDV可以誘導(dǎo)IFN-α、IFN-β、IFN-γ的產(chǎn)生[4,23-24],并且即使無復(fù)制活性的NDV也可以使人外周血單核細胞分泌 IFN-α增加[25]。IFN-α的抗腫瘤機制主要有直接作用于腫瘤細胞和間接調(diào)節(jié)免疫功能兩個方面,間接調(diào)節(jié)免疫功能的主要途徑就是促進腫瘤壞死因子家族介導(dǎo)的細胞凋亡。IFN-α可以通過激活JA K-STA T途徑誘導(dǎo) TRAIL(TNF-related Apoptosis-inducing Ligand)等分子的表達,還可以增強 FasL表達,TRAIL與FasL與腫瘤細胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以啟動caspase級聯(lián)反應(yīng),最終裂解核蛋白、細胞骨架、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。另外,IFN-α還可在轉(zhuǎn)錄水平增強 P53[26]、Bax[27]等凋亡相關(guān)基因的表達,來增強它的抗腫瘤功能。NDV具有強大的 IFN-β誘生能力,陳輝等人[28]選用3株人肝細胞系 PH5CH8、Huh7、Hep G2作為研究對象,使用NDV與多聚次黃苷酸-胞苷酸〔poly(I:C)〕作為 IFN-β誘生劑處理上述3種細胞,從轉(zhuǎn)錄、蛋白水平及功能學(xué)角度檢測產(chǎn)生 IFN-β的能力。結(jié)果顯示,PH5CH8細胞經(jīng)NDV誘導(dǎo)后,IFN-β水平升高了327.20倍。IFN-γ則可以通過直接抑制腫瘤細胞、增強宿主對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)等途徑干擾宿主與腫瘤間的相互關(guān)系等方面來發(fā)揮抗腫瘤作用[29]。另外,IFN-γ還可以通過抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[30]。IFN與IL-2、TNF具有相互協(xié)同促進作用,IL-2誘導(dǎo)N K細胞活化增殖后可引起 TNF和 IFN-γ的釋放,TNF和腫瘤細胞膜上的TNF受體結(jié)合后可以直接或間接破壞腫瘤細胞,IFN能上調(diào)腫瘤細胞表面的 TNF受體的表達而協(xié)同 TNF抗腫瘤,IFN與IL-2、TNF均可促進FasL的表達,而FasL與靶細胞表面上的 Fas分子相互作用,啟動信號傳導(dǎo)過程,導(dǎo)致靶細胞內(nèi)源性自殺程序激活,是誘導(dǎo)靶細胞凋亡的主要途徑之一。NDV誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN、IL-2與 TNF是否可以通過此途徑協(xié)同作用來間接促進NDV的抗腫瘤作用,仍然需要我們進一步的研究。

4 集落刺激因子 (Colony Stimulating Factor,CSF)

集落刺激因子是指能夠刺激多能造血干細胞和不同發(fā)育分化階段的造血干細胞進行增殖分化,并在半固體培養(yǎng)基中形成相應(yīng)集落的細胞因子。集落刺激因子種類繁多,包括巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-CSF,M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte-csf,G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、多重集落刺激因子(multi-CSF,即IL-3)、干細胞生長因子(stem cell factor,SCF)、紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)以及血小板生成素(thrombopoietin,TPO)等。將外源性 GMCSF基因?qū)肽[瘤細胞中可以促進APC的成熟,并且提高其對腫瘤抗原的遞呈和加工處理能力[31,32]。NDV可以誘導(dǎo) GM-CSF和M-CSF的分泌[4],并且NDV的固有抗腫瘤作用和免疫刺激作用可以通過引入外源性的 GM-CSF基因來進一步的增強,同時伴隨著IFN-α的分泌量顯著增加[33]。

5 一氧化氮(Nitric Oxide,NO)

NO是生物體內(nèi)一種結(jié)構(gòu)簡單的自由基,是機體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子,具有重要的生理功能,在殺傷腫瘤方面有重要意義,是活化的巨噬細胞殺傷腫瘤細胞時產(chǎn)生的毒性效應(yīng)因子之一。對于NDV可以誘導(dǎo)NO分泌以及誘導(dǎo)分泌的NO的抗腫瘤作用,國內(nèi)外許多學(xué)者分別從體外、體內(nèi)等方面進行了大量的研究。Umansky等人[34]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)NDV作用人的外周血單核細胞后產(chǎn)生NO,釋放出來的NO與NDV殺傷腫瘤細胞有密切的關(guān)系,NO可導(dǎo)致巨噬細胞核的NF-κB因子活化,從而活化巨噬細胞。將NDV-L作用于人外周血粘附性單個核細胞(a-PBMCs)2～4 h后,可發(fā)現(xiàn)NDV-L相對穩(wěn)定地吸附在其表面,并誘導(dǎo)其釋放一氧化氮,而且NO的釋放量與病毒滴度有關(guān),當病毒滴度在10-6～10-9時,NO的分泌量維持在一個相對穩(wěn)定的高水平。使用3H-TdR釋放法測定NDV-L作用的a-PBMCs對 K562細胞的細胞毒活性,發(fā)現(xiàn)具有明顯的殺傷效應(yīng),并且殺傷效應(yīng)與NO的產(chǎn)生有一定的依賴性[35]。Schirrmacher U等人[36]使用2種不同的NDV毒株、不同來源的巨噬細胞、不同的鼠系(DBA/2,C57BL/6,615)在不同的條件下研究NDV體內(nèi)外激活鼠巨噬細胞的抗腫瘤活性的能力時,發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤作用的效應(yīng)物質(zhì)如NO、TNF-α的產(chǎn)生。

6 其他細胞因子和趨化因子

唐省三等人以人膀胱癌EJ細胞株為靶細胞,研究NDV對體外腫瘤細胞的抑制作用機制時,使用免疫組化的方法檢測到 TGF-β1表達增加,TGF-β1與其受體或抑制成分結(jié)合蛋白結(jié)合而誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡[37]。

NDV具有誘導(dǎo) T細胞共刺激活性、防止無能誘導(dǎo)以及誘導(dǎo)局部趨化因子如RAN TES、IP10等的作用,T細胞通過趨化因子聚集于接種局部,導(dǎo)致腫瘤特異性 T淋巴細胞活化,此種特異性 T淋巴細胞有兩型,一是記憶細胞,另一是初始 T細胞,此兩種細胞活化后產(chǎn)生腫瘤特異性記憶 T細胞,重新參與體循環(huán),再一次接觸腫瘤相關(guān)抗原。就可以通過介導(dǎo)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生而誘導(dǎo)局部抗腫瘤免疫反應(yīng),新產(chǎn)生的這些因子又可以進一步聚集其他 T細胞,最終消滅腫瘤細胞[38]。

綜上所述,NDV誘導(dǎo)分泌的抗腫瘤作用相關(guān)細胞因子種類繁多,它們之間的關(guān)系也很復(fù)雜,我們知道,細胞因子發(fā)揮作用具有多效性和重疊性的特點,而且不同細胞因子之間具有協(xié)同和拮抗的作用,其合成和分泌相互調(diào)節(jié),受體表達相互調(diào)控,共同組成了復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮其作用。如文中所述,IFN與IL-2、TNF具有相互協(xié)同促進作用:IL-2可以促進干擾素、腫瘤壞死因子等的分泌,IFN能上調(diào)腫瘤細胞表面的 TNF受體的表達而協(xié)同 TNF抗腫瘤,另外,IFN與 IL-2、TNF均可上調(diào) FasL的表達,細胞因子之間通過這種互相協(xié)同促進作用可使其抗腫瘤效能進一步放大。但是,NDV誘導(dǎo)產(chǎn)生的眾多細胞因子之間具有什么協(xié)同或拮抗的作用呢?目前此類的研究較少,關(guān)于NDV誘導(dǎo)細胞因子的研究主要是研究NDV誘導(dǎo)某種或某幾種細胞因子后的抗腫瘤作用觀察,或者是NDV與某些細胞因子聯(lián)合應(yīng)用后的抗腫瘤效果對比。

7 問題與展望

NDV抗癌活性顯著,目前很多人致力于研究NDV的抗腫瘤機制,但是從NDV誘導(dǎo)細胞因子的角度來觀察其抗腫瘤作用的研究卻為數(shù)不多。而且就目前的研究形勢來看,針對NDV誘導(dǎo)產(chǎn)生某一種或幾種細胞因子后的抗腫瘤作用的研究較為常見,對NDV誘導(dǎo)產(chǎn)生的眾多細胞因子抗腫瘤途徑的研究則為數(shù)不多,特別是對這些細胞因子之間的聯(lián)系、協(xié)同作用的研究非常有限。所以至今我們對NDV誘導(dǎo)產(chǎn)生的眾多細胞因子之間的相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及它們是如何系統(tǒng)地完成整個抗腫瘤過程的,仍然缺乏一個完整的認識。NDV誘導(dǎo)產(chǎn)生的眾多細胞因子之間有何關(guān)聯(lián)?它們之間是如何協(xié)同或拮抗的?它們在NDV抗腫瘤機制中到底扮演了一個什么角色?以及還有沒有我們沒有發(fā)現(xiàn)的NDV誘導(dǎo)的抗腫瘤相關(guān)細胞因子?這些問題仍然需要我們進一步的研究。

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