20世紀(jì)70年代中后期吡喹酮的發(fā)現(xiàn)是血吸蟲(chóng)病治療藥物的里程碑[1]。吡喹酮具有高效、低毒、廣譜、使用方便和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn),使血吸蟲(chóng)病的治療取得了真正的突破。據(jù)此,WHO血吸蟲(chóng)病控制策略的目標(biāo)已由阻斷傳播轉(zhuǎn)為疾病控制,以吡喹酮為主的周期性化療成為當(dāng)前疾病控制的主要手段[2]。同時(shí)我國(guó)血吸蟲(chóng)病的防治策略也作了相應(yīng)的調(diào)整。從20世紀(jì) 80年代至今,我國(guó)累計(jì)有5 000萬(wàn)例(次)以上血吸蟲(chóng)病患者接受了吡喹酮治療(包括擴(kuò)大化療)[3]。盡管血吸蟲(chóng)病疫苗、藥物開(kāi)發(fā)及導(dǎo)致疾病的免疫機(jī)制方面的基礎(chǔ)研究是國(guó)際上近幾年的研究熱點(diǎn)[4],可無(wú)論是早期的蟲(chóng)體抗原苗、輻射致弱童蟲(chóng)苗,或近十多年來(lái)研制的現(xiàn)代生物技術(shù)疫苗尚不宜在現(xiàn)場(chǎng)推廣應(yīng)用,或誘導(dǎo)的保護(hù)效果不甚理想[5]。目前血吸蟲(chóng)病的防治仍主要依賴于化學(xué)治療[6]。

同一種抗蠕蟲(chóng)藥物的過(guò)度應(yīng)用、使用劑量的不足及結(jié)合其他因素,往往會(huì)導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生[7]：在非洲一些地區(qū),曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosoma mansoni)對(duì)在該地區(qū)廣泛用于抗蟲(chóng)治療的口服藥海恩酮和奧沙尼喹產(chǎn)生了抗藥性[8-9];Fallon等[10]在實(shí)驗(yàn)室采用吡喹酮亞治療量誘導(dǎo)出了曼氏血吸蟲(chóng)吡喹酮抗性株,證實(shí)在藥物壓力下血吸蟲(chóng)可對(duì)吡喹酮產(chǎn)生抗藥性。我國(guó)是日本血吸蟲(chóng)病流行的主要國(guó)家[11-12],感染宿主體內(nèi)的日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum)在持續(xù)藥物壓力下可能對(duì)吡喹酮產(chǎn)生一定的耐受性[13]。盡管現(xiàn)場(chǎng)至今尚未發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株對(duì)吡喹酮敏感性下降的證據(jù)[14],但我們?nèi)孕杳芮斜O(jiān)測(cè)日本血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮是否產(chǎn)生抗藥性。本文從現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)室兩方面就血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮抗藥性監(jiān)測(cè)指標(biāo)進(jìn)行綜述,旨在為研發(fā)快速、敏感、簡(jiǎn)單的日本血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮抗藥性現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)

1.1 治愈率(糞檢陰轉(zhuǎn)率) 治愈率的高低在一定程度上可以反映血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮的敏感性。以往的研究業(yè)已證明,采用40 mg/kg吡喹酮頓服療法治療日本血吸蟲(chóng)病人,可獲得97.6%～100.0%治愈率[15],但采用相同療法治療曼氏血吸蟲(chóng)病人,治愈率通常只有60.0%～90.0%[15-16]。由此可以看出日本血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮的敏感性高于曼氏血吸蟲(chóng)。杭盤(pán)宇等[17]對(duì)不同階段日本血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮敏感性的研究結(jié)果與曼氏血吸蟲(chóng)相比較,日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)、尾蚴、毛蚴和蟲(chóng)卵對(duì)吡喹酮更為敏感,進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。梁幼生[14]等現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查結(jié)果顯示,采用40 mg/kg吡喹酮一次頓服的治愈率達(dá)95.1%,2次的治愈率為100%,由此提示盡管在我國(guó)血吸蟲(chóng)病主要流行區(qū)采用吡喹酮實(shí)施大規(guī)模化療已10余年,但現(xiàn)場(chǎng)尚未發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株對(duì)吡喹酮敏感性下降的證據(jù)。在非洲北塞內(nèi)加爾采用標(biāo)準(zhǔn)劑量吡喹酮治療曼氏血吸蟲(chóng)病的治愈率僅為18%～36%,增加治療劑量并不能明顯提高治愈率[18-19];繼而又在埃及發(fā)現(xiàn)部分患者經(jīng)反復(fù)治療難以治愈[20]。鑒于人群化療仍是當(dāng)前血吸蟲(chóng)病防治的一個(gè)重要措施,是否出現(xiàn)了吡喹酮抗性蟲(chóng)株的問(wèn)題引起了科學(xué)界的重視[21]。Raso等[22]在治療曼氏血吸蟲(chóng)病的研究中對(duì)223名糞檢陽(yáng)性者采用40 mg/kg的吡喹酮頓服,6 w后評(píng)價(jià),治愈率僅為60.9%,接近正常范圍底線。Van等[23]報(bào)道,在Ndombo,同樣的治療劑量只取得28%的治愈率,即使是中度或輕度感染治愈率也顯著低于正常水平。雖然Cryseels等[24]學(xué)者認(rèn)為,在這些流行區(qū)應(yīng)用吡喹酮治療的治愈率低不單單與抗藥性產(chǎn)生有關(guān),可能還與患者體內(nèi)蟲(chóng)負(fù)荷高,頻繁的再感染以及治療時(shí)患者體內(nèi)存在處于對(duì)藥物不敏感階段的童蟲(chóng)有關(guān),但是,曼氏血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮的現(xiàn)場(chǎng)抗藥性問(wèn)題必須予以高度的關(guān)注。

1.2 減蟲(chóng)卵率 家畜最常用于檢測(cè)蠕蟲(chóng)抗藥性的方法是比較藥物治療前后糞便中的蟲(chóng)卵減少率,并且已制定出一部用于評(píng)價(jià)家畜線蟲(chóng)抗藥性的標(biāo)準(zhǔn)化方案[25]。在血吸蟲(chóng)病人治療前、后作蟲(chóng)卵計(jì)數(shù),可以觀察到藥物對(duì)不同感染度病人的療效,補(bǔ)充陰轉(zhuǎn)率的結(jié)果[26]。在塞內(nèi)加爾北部,有些學(xué)者[27-31]在研究曼氏血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮抗藥性時(shí)以蟲(chóng)卵轉(zhuǎn)陰率作為監(jiān)測(cè)指標(biāo),并計(jì)算了減蟲(chóng)卵率來(lái)補(bǔ)充陰轉(zhuǎn)率的結(jié)果。其中Tchuem Tchuente LA[31]等對(duì)該地區(qū)43例以往經(jīng)過(guò)至少2次吡喹酮治療而糞便中仍能檢出曼氏血吸蟲(chóng)卵者予以吡喹酮40 mg/kg 2次療法,2次間隔4 w。結(jié)果第1次治療后4 w復(fù)查,蟲(chóng)卵陰轉(zhuǎn)率為58.1%,蟲(chóng)卵減少率為60.8%;第2次治療后4 w復(fù)查,陰轉(zhuǎn)率仍為58.1%,蟲(chóng)卵減少率為56.2%。按感染度分類(lèi)統(tǒng)計(jì),輕度感染組的蟲(chóng)卵陰轉(zhuǎn)率較高,重度感染組的蟲(chóng)卵陰轉(zhuǎn)率較低,蟲(chóng)卵減少率則相反。

現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)受許多因素的影響,如診斷標(biāo)準(zhǔn)、藥物來(lái)源、劑量、治療間隔時(shí)間、藥效評(píng)價(jià)時(shí)間等[2],并與再感染密切相關(guān)。特別是在血吸蟲(chóng)病重度流行區(qū),再感染率達(dá)15%～55%[32-33],使治愈率、減蟲(chóng)卵率下降,同時(shí)也降低了敏感性監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性。

2 實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)指標(biāo)

2.1 體內(nèi)檢測(cè)指標(biāo)

2.1.1 減蟲(chóng)率(成蟲(chóng)存活率)、減蟲(chóng)卵率(肝卵減少率、糞卵減少率) 吡喹酮敏感性的檢測(cè)通常是以待檢血吸蟲(chóng)蟲(chóng)株感染實(shí)驗(yàn)小鼠,在用待檢藥物進(jìn)行治療后檢測(cè)感染鼠的血吸蟲(chóng)減蟲(chóng)率[10,20,34-35]。梁幼生等[35]對(duì)來(lái)自北塞內(nèi)加爾未治愈的曼氏血吸蟲(chóng)病患者體內(nèi)及由實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)產(chǎn)生的5個(gè)抗性株和5個(gè)實(shí)驗(yàn)室保存的敏感株在小鼠體內(nèi)對(duì)吡喹酮的敏感性進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)敏感株的減蟲(chóng)率為91.8%～100%,而抗性株的減蟲(chóng)率僅為59.6%～74.4%。由此得出結(jié)論：5個(gè)曼氏血吸蟲(chóng)抗性株對(duì)吡喹酮的敏感性顯著低于5個(gè)敏感株。石孟芝等[36]從中國(guó)湖南省一個(gè)未經(jīng)吡喹酮群體化療的新發(fā)現(xiàn)流行區(qū)(感染率為11%)和一個(gè)在14年內(nèi)經(jīng)吡喹酮多次群體化療的老疫區(qū)(感染率為8.2%)這2個(gè)流行區(qū)分別采集感染性釘螺逸蚴感染小鼠,采用吡喹酮600 mg/kg 1次灌服治療感染小鼠,治后3 w剖檢,結(jié)果反復(fù)化療的老疫區(qū)組與新疫區(qū)組小鼠的減蟲(chóng)率分別為98.2%和98.7%,肝卵減少率分別為 75.85%、73.10%,糞卵減少率則各為99.94%、99.64%。提示在反復(fù)應(yīng)用吡喹酮化療的血吸蟲(chóng)病流行區(qū),吡喹酮治療日本血吸蟲(chóng)病的效果無(wú)明顯變化。

2.1.2 半數(shù)有效量(ED50) ED50是判斷微生物及寄生蟲(chóng)抗藥性的重要指標(biāo)。Ismail等[37]和 Bennett[38]在埃及尼羅河三角洲從經(jīng)吡喹酮反復(fù)治療3次仍未治愈的患者糞便中分離蟲(chóng)卵建立蟲(chóng)株,并感染小鼠進(jìn)行蟲(chóng)株的藥物敏感試驗(yàn)。結(jié)果有80%的蟲(chóng)株ED50(123～680 mg/kg)明顯高于1次治愈患者體內(nèi)分離蟲(chóng)株的ED50(80～104 mg/kg)。Cioli等[39]測(cè)定了曼氏血吸蟲(chóng)敏感株(未經(jīng)吡喹酮作用)和抗性株(實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)或現(xiàn)場(chǎng)多次治療失效)的ED50,結(jié)果 ,抗性株的 ED50均大于100 mg/kg,且抗性株的ED50約為敏感株的3倍,作者認(rèn)為100 mg/kg可作為區(qū)分敏感性的ED50的界值。但是,該項(xiàng)指標(biāo)仍需在今后更多的蟲(chóng)株敏感性測(cè)定中加以驗(yàn)證。當(dāng)然,也有學(xué)者提出,僅僅靠ED50的高低,尚不足以作為評(píng)價(jià)抗性的依據(jù)。關(guān)鍵要看在藥物壓力下,能否選擇出可以遺傳的抗性表型以及隨著反復(fù)傳代,在種群中抗性表型能否擴(kuò)大化從而對(duì)人類(lèi)構(gòu)成威脅[40-41]。

2.1.3 病理指標(biāo)

2.1.3.1 蟲(chóng)體皮層損傷程度 梁幼生等[42]用曼氏血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮敏感株及抗性株尾蚴分別感染小鼠,感染后第57 d,以300 mg/kg微?；拎獞乙簩?duì)小鼠作灌胃治療;在灌藥后 10、30min和1、12、24 h后剖殺感染小鼠,門(mén)靜脈灌注收集成蟲(chóng),按常規(guī)方法制成掃描電鏡標(biāo)本,掃描電鏡下觀察成蟲(chóng)體表的變化。結(jié)果表明,在用同等劑量的吡喹酮治療時(shí),敏感株蟲(chóng)體體表受損程度明顯重于抗性株蟲(chóng)體,且雄蟲(chóng)體表的損害又較雌蟲(chóng)的為重。William等[43]用曼氏血吸蟲(chóng)吡喹酮抗性株和敏感株作體外實(shí)驗(yàn)觀察吡喹酮對(duì)蟲(chóng)皮層的損害,亦獲得相同的結(jié)果。

2.1.3.2 蟲(chóng)卵肉芽腫面積 蟲(chóng)卵導(dǎo)致的肉芽腫是血吸蟲(chóng)病的基本病理變化,它能造成組織持久性的結(jié)構(gòu)與功能破壞,在臨床上有重要的意義。梁幼生等[44]用曼氏血吸蟲(chóng)抗性株與敏感株尾蚴感染小鼠,在感染第58、59、60 d每日以 200 mg/kg微?；拎獞乙汗辔钢委熜∈?治后35 d剖殺小鼠取小鼠肝臟做石蠟切片進(jìn)行HE染色,顯微鏡下作病理學(xué)觀察,以圖像分析儀定量測(cè)定蟲(chóng)卵肉芽腫的面積。結(jié)果敏感株未治療組蟲(chóng)卵肉芽腫由大量炎性浸潤(rùn)細(xì)胞及少量間質(zhì)成纖維細(xì)胞組成;治療組則由少量炎性浸潤(rùn)和大量間質(zhì)成纖維細(xì)胞組成;未治療組肉芽腫的面積明顯大于治療組,兩者間差異具有非常顯著性。但抗性株治療組和未治療組蟲(chóng)卵肉芽腫均由大量炎性浸潤(rùn)細(xì)胞和少量間質(zhì)成纖維細(xì)胞組成,兩組蟲(chóng)卵肉芽腫的面積差異無(wú)顯著性。研究表明鼠體內(nèi)吡喹酮的治療對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)吡喹酮敏感株和抗性株肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫的形成影響作用具有顯著差異;在肝組織中,敏感株蟲(chóng)卵對(duì)吡喹酮的敏感性高于抗性株。

2.1.4 生物學(xué)特性指標(biāo)

2.1.4.1 對(duì)宿主螺的易感性和產(chǎn)尾蚴量指標(biāo) 梁幼生等[45]以曼氏血吸蟲(chóng)抗性株與敏感株毛蚴和尾蚴定量感染光滑雙臍螺和CD1小鼠,宿主體內(nèi)觀察比較曼氏血吸蟲(chóng)吡喹酮抗性株和敏感株生物學(xué)特性。結(jié)果：?jiǎn)沃宦荼┞队趩蝹€(gè)毛蚴2 h,抗性株與敏感株對(duì)螺感染率為19.8%和8.9%,兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006);逸蚴期間,塞內(nèi)加爾抗性株感染螺存活率高于敏感株;用塞內(nèi)加爾抗性株和敏感株毛蚴感染所獲陽(yáng)性螺產(chǎn)尾蚴量(尾蚴/螺)為6 875條和14 611條,抗性株和敏感株的尾蚴逸出量間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3個(gè)塞內(nèi)加爾抗性株尾蚴開(kāi)放前期平均為32.2 d,而 3個(gè)敏感株尾蚴的為27.7 d,兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。塞內(nèi)加爾抗性株與敏感株間的蟲(chóng)卵開(kāi)放前期及蟲(chóng)卵孵化率間的差異則被認(rèn)為是曼氏血吸蟲(chóng)不同地理株間的差異。

2.1.4.2 對(duì)小鼠的易感性及排卵量指標(biāo) 梁幼生等[46]采用浸尾法以200尾蚴/鼠逐只感染遠(yuǎn)交系CD1鼠,感染57 d后采集鼠糞便計(jì)數(shù)蟲(chóng)卵;78 d后剖殺鼠收集成蟲(chóng)計(jì)數(shù)并摘取肝臟和腸做組織蟲(chóng)卵計(jì)數(shù);95 d后取肝臟組織切片、染色測(cè)量蟲(chóng)卵肉芽腫面積和周長(zhǎng)。對(duì)抗性株與敏感株進(jìn)行比較：結(jié)果抗性株和敏感株感染鼠成蟲(chóng)回收數(shù)相仿,分別為22.5條/鼠和21.8條/鼠;抗性株感染鼠糞便蟲(chóng)卵數(shù)為68.6只/100 mg,敏感株為31.7只/100 mg,兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;感染第78 d,敏感株產(chǎn)于肝和腸組織蟲(chóng)卵數(shù)為4 665只/對(duì)成蟲(chóng),抗性株為8 364只/對(duì)成蟲(chóng),兩者間的差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;抗性株和敏感株感染鼠肝蟲(chóng)卵肉芽腫面積及周長(zhǎng)間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

體內(nèi)檢測(cè)指標(biāo)目前仍沿用小鼠體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療的方法,但因其成本高、費(fèi)時(shí)及影響因素多等,僅局限于實(shí)驗(yàn)室研究使用[47]。況且在寄生蟲(chóng)藥物抗性株與敏感株生物學(xué)特性比較研究中所發(fā)現(xiàn)的差異,是寄生蟲(chóng)種群間自然變異,還是與抗性相關(guān)生物學(xué)特性,往往難以區(qū)別[48]。

2.2 體外監(jiān)測(cè)指標(biāo)

2.2.1 血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)

2.2.1.1 蟲(chóng)肌肉張力 Ismail等[49]對(duì)從吡喹酮治療失效病人體內(nèi)分離到的12株曼氏血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)在吡喹酮作用下的蟲(chóng)肌肉張力的變化進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)抗性株蟲(chóng)體的反應(yīng)強(qiáng)度明顯低于敏感株蟲(chóng)體。在鼠體內(nèi)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的對(duì)吡喹酮的敏感性與體外測(cè)得的蟲(chóng)體肌肉的收縮強(qiáng)度存在良好的相關(guān)性。然而,該方法操作程序復(fù)雜,并需要專(zhuān)門(mén)的儀器,難以在現(xiàn)場(chǎng)使用。

2.2.1.2 成蟲(chóng)存活率 Sobhon和 Upatham報(bào)告,將血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)孵育于含同一濃度吡喹酮的MEM中,曼氏血吸蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)和湄公血吸蟲(chóng)(Schistosoma mekongi)存活率間存有顯著不同;同種血吸蟲(chóng)雌與雄蟲(chóng)的反應(yīng)性也不同,與雌蟲(chóng)相比,雄蟲(chóng)顯得更為敏感[50]。梁幼生等[51]在比較曼氏血吸蟲(chóng)吡喹酮敏感株與抗性株成蟲(chóng)對(duì)吡喹酮的體外反應(yīng)性結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Sobhon和Upatham的結(jié)果。

2.2.2 尾蚴(斷尾率) 一定濃度的吡喹酮作用于尾蚴體與尾部肌肉,使得血吸蟲(chóng)尾蚴的體與尾部出現(xiàn)分離[52-54]。將曼氏血吸蟲(chóng)尾蚴移入4×10-7mol/L吡喹酮溶液中80～100 min后,鏡下計(jì)數(shù)其斷尾率,比較抗性株和敏感株尾蚴斷尾率間的差異作為曼氏血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮敏感性的檢測(cè)方法,可用于吡喹酮抗性蟲(chóng)株的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。由于吡喹酮敏感株與抗性株尾蚴肌肉相應(yīng)的靶位對(duì)吡喹酮敏感性存在差異,當(dāng)尾蚴暴露于相同濃度的吡喹酮中,其反應(yīng)性(肌肉收縮的強(qiáng)度)也必然存在差異。尾蚴的斷尾率作為反映這一差異較客觀的指標(biāo),在吡喹酮抗性監(jiān)測(cè)上具有一定的意義[55]。2007年,梁幼生等[56]研究顯示,將日本血吸蟲(chóng)尾蚴移至4×10-7mol/L吡喹酮溶液中80～100 min后,鏡下計(jì)數(shù)其斷尾率,用于判斷該日本血吸蟲(chóng)分離株對(duì)吡喹酮的敏感性,此法可用于吡喹酮敏感性蟲(chóng)株的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。同年梁幼生等[57]在曼氏血吸蟲(chóng)中比較吡喹酮敏感株雌雄斷尾率、吡喹酮抗性株雌雄尾蚴斷尾率、敏感株與抗性株雄性斷尾率時(shí)發(fā)現(xiàn)：曼氏血吸蟲(chóng)雌雄尾蚴對(duì)吡喹酮的敏感性存在差異,雄性尾蚴敏感性高于雌性;曼氏血吸蟲(chóng)吡喹酮抗性的產(chǎn)生與雄蟲(chóng)對(duì)吡喹酮的敏感性降低有關(guān)。

2.2.3 毛蚴(變形率) 一定濃度的吡喹酮可使得血吸蟲(chóng)毛蚴發(fā)生形態(tài)學(xué)變化[52,58]。將吡喹酮敏感株和抗性株毛蚴分別暴露于 10-3、10-4、10-5、5×10-6、10-6、5×10-7mol/L 和 10-7mol/L 吡喹酮溶液中,0、1、5 min后觀察比較毛蚴的運(yùn)動(dòng)及形態(tài)學(xué)變化。當(dāng)毛蚴暴露于5×10-6mol/L吡喹酮溶液中,敏感株100%毛蚴體中部立刻收縮變形,而抗性株僅見(jiàn)13.4%毛蚴變形;當(dāng)暴露于10-6mol/L吡喹酮溶液0、1、5 min后敏感株毛蚴的變形率分別為35.5%、63.9%、91.2%;抗性株毛蚴的變形率分別為0、7.6%、14.3%。敏感株毛蚴的變形率與抗性株間差異有非常顯著性。實(shí)驗(yàn)表明,對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)來(lái)說(shuō),將一定量剛孵出的毛蚴移入10-6mol/L溶液中1 min后,滴加盧戈氏碘液,顯微鏡下計(jì)數(shù)變形毛蚴所占比例,可用于現(xiàn)場(chǎng)判斷病人化療失敗的原因是由于吡喹酮抗性株造成或是因其他因素如再感染等引起。對(duì)于日本血吸蟲(chóng)來(lái)說(shuō),將一定量剛孵出的毛蚴移入含吡喹酮5×10-7mol/L的溶液中按上述操作進(jìn)行也可用于判斷病人化療失敗的原因[56]。

體外尾蚴、毛蚴抗性檢測(cè)技術(shù)只需直接從現(xiàn)場(chǎng)采集陽(yáng)性螺逸出尾蚴、采集病人糞便孵化毛蚴即可進(jìn)行檢測(cè),勿需使用動(dòng)物和特殊設(shè)備,是簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)及可直接用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)吡喹酮抗藥性的方法[47,56]。

2.2.4 蟲(chóng)卵(孵化率)[47]將吡喹酮敏感株和抗性株蟲(chóng)卵分別孵育于 5×10-6、10-6、5×10-7mol/L和10-7mol/L吡喹酮溶液中24 h,后移至清水孵化,比較蟲(chóng)卵的孵化率。結(jié)果經(jīng)10-6mol/L和5×10-7mol/L吡喹酮孵育24 h后,敏感株曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的孵化率分別為4.2%和30.7%,抗性株分別為24.2%和61.2%,兩者間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由于血吸蟲(chóng)生活史中從蟲(chóng)卵開(kāi)始,毛蚴、尾蚴均存在于體外,血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)也能夠人工培養(yǎng),這就為體外直接檢測(cè)血吸蟲(chóng)對(duì)抗蟲(chóng)藥物的抗性提供了基礎(chǔ)[59]。研究發(fā)現(xiàn),日本血吸蟲(chóng)各現(xiàn)場(chǎng)分離株間在蟲(chóng)卵、毛蚴和尾蚴階段對(duì)吡喹酮的敏感性無(wú)明顯差異,但均明顯高于曼氏血吸蟲(chóng)[56];曼氏血吸蟲(chóng)吡喹酮敏感株與抗性株在蟲(chóng)卵與毛蚴階段對(duì)吡喹酮的體外反應(yīng)性差異有顯著性,證明血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮的抗性有可能表現(xiàn)在各個(gè)生活階段。運(yùn)用這些體外反應(yīng)性的差異,建立相應(yīng)抗性檢測(cè)技術(shù),對(duì)吡喹酮抗性的診斷和監(jiān)測(cè)具有重要的意義[47]。

2.2.5 分子生物學(xué)指標(biāo)

2.2.5.1 差異蛋白 曲國(guó)立等[60]對(duì)中國(guó)大陸日本血吸蟲(chóng)不同地理株間成蟲(chóng)差異表達(dá)蛋白的分離、鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同地理株蟲(chóng)體可溶性蛋白組分蛋白點(diǎn)在600～700之間,兩兩比較發(fā)現(xiàn)雌蟲(chóng)蛋白質(zhì)表達(dá)存在18個(gè)差異點(diǎn),雄蟲(chóng)存在14個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn),且地理株間兩兩均有差異,提示自然狀態(tài)下的不同地理株血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上的差異,可能是環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。部分蛋白表達(dá)差異與蟲(chóng)體對(duì)吡喹酮敏感性密切相關(guān)。

2.2.5.2 線粒體細(xì)胞色素氧化酶-C亞單位1[61]利用PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選抗性分離株以及從塞內(nèi)加爾和埃及分離的可疑抗性株進(jìn)行與藥物抗性表型相關(guān)的遺傳和生理學(xué)差異的研究提示,實(shí)驗(yàn)室篩選抗性株成蟲(chóng)表達(dá)的線粒體細(xì)胞色素氧化酶-C亞單位1比其親代高5～10倍,而其活性卻要低4倍。

2.2.4.3 DNA核苷酸序列[62]隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,埃及的抗性株與來(lái)自同一地區(qū)的敏感株相比較,至少有2個(gè)主要的DNA核苷酸序列擴(kuò)增并不相同。

2.2.5.4 β亞單位基因[63]在對(duì)吡喹酮作用的靶器官-鈣離子通道的β亞單位基因的研究發(fā)現(xiàn),血吸蟲(chóng)的β亞單位基因的主要結(jié)構(gòu)成分與其他已知的β亞單位基因不同,將血吸蟲(chóng)β亞單位基因轉(zhuǎn)染入非血吸蟲(chóng)細(xì)胞可以增加后者對(duì)吡喹酮的敏感性。

梁幼生[64]等對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)吡喹酮抗性的遺傳學(xué)分析顯示：抗性遺傳結(jié)果遵循孟德?tīng)栠z傳定律,并認(rèn)為曼氏血吸蟲(chóng)吡喹酮抗性是有單一或一組顯性基因所決定。由此提示有可能采用分子生物學(xué)方法建立吡喹酮抗性檢測(cè)技術(shù)。隨著血吸蟲(chóng)基因測(cè)序以及人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成,生命科學(xué)已進(jìn)入了后基因組時(shí)代,分子生物學(xué)技術(shù)將更加有利于我們精確區(qū)分抗性株和敏感株蟲(chóng)體間的差異。但由于該技術(shù)需要專(zhuān)門(mén)的技術(shù)人員及儀器,操作復(fù)雜,費(fèi)用相對(duì)較高,作為常規(guī)化的檢測(cè)方法在現(xiàn)場(chǎng)使用可能會(huì)有局限性。

3 結(jié) 語(yǔ)

吡喹酮是治療人體5種血吸蟲(chóng)感染的主要藥物,也是治療日本血吸蟲(chóng)病的惟一抗蟲(chóng)藥[65]?？顾幮缘漠a(chǎn)生是寄生蟲(chóng)種群在藥物選擇壓力下出現(xiàn)的一種適應(yīng)性反應(yīng),這種反應(yīng)是生理性的和可遺傳的,涉及遺傳基因的改變[7]?？顾幮缘某霈F(xiàn)是一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題[66]。監(jiān)測(cè)血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮抗藥性的研究具有重大意義,尤其是中國(guó)要加強(qiáng)日本血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮抗藥性的監(jiān)測(cè)的研究,以控制抗藥性基因在流行區(qū)蔓延和更有效地防治血吸蟲(chóng)病[67]。

自2005年3月以來(lái),我國(guó)已設(shè)立了80個(gè)血吸蟲(chóng)病疫情縱向監(jiān)測(cè)點(diǎn)[68],這些監(jiān)測(cè)點(diǎn)對(duì)疫情實(shí)施系統(tǒng)、連續(xù)不斷地監(jiān)測(cè),在預(yù)防和控制血吸蟲(chóng)病工作中發(fā)揮了重要作用。如今,隨著我國(guó)血吸蟲(chóng)病防治進(jìn)程的推進(jìn),如何建立快速、敏感的吡喹酮抗藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)并在監(jiān)測(cè)點(diǎn)中廣泛運(yùn)用,充分發(fā)揮監(jiān)測(cè)點(diǎn)的作用,推動(dòng)血吸蟲(chóng)病監(jiān)測(cè)與預(yù)警體系的完善,是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

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