宋 芳,周 玉,盧士英,任洪林,李巖松,柳增善,劉文迪,郝亞明

(人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130062)

牛奶具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,牛奶中含有多種人類賴以生存的營(yíng)養(yǎng)素,包括水、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素等,是人類最理想的天然食品。然而近些年來(lái),隨著乳制品產(chǎn)量的逐漸上升,乳品摻假現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生,嚴(yán)重危害消費(fèi)者健康。牛奶中最重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)是蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)測(cè)定方法是凱氏定氮法,該方法只能測(cè)出氮的總量而不能確定氮的來(lái)源和種類,所以存在一定的缺欠,這使得不法商人將低價(jià)含氮物質(zhì)如尿素、三聚氰胺、硝酸鹽、亞硝酸鹽、白礬、豆?jié){等[1]摻入牛奶中,以達(dá)到牛奶中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

牛奶中的蛋白質(zhì)是奶中主要含氮物質(zhì),含量為2.8%-3.8%,其中95%是乳蛋白質(zhì),牛乳蛋白質(zhì)中大約80%是酪蛋白,β-酪蛋白在酪蛋白中比例恒定,結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定[2]。因此,如果能直接檢測(cè)牛奶中β-酪蛋白的含量,可使得在牛奶中添加含氮類非食品添加劑的行為變得毫無(wú)“意義”。

目前,牛奶中β-酪蛋白的檢測(cè)方法有酪蛋白等電點(diǎn)沉淀法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[5]等,這些方法的缺點(diǎn)是依靠昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)操作人員,不便以普及和推廣?；趩慰寺】贵w的ELISA檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)操作人員等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)制備了β-酪蛋白的單克隆抗體并對(duì)其特性進(jìn)行了鑒定,為牛奶中蛋白質(zhì)的ELISA檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

牛乳β-酪蛋白(純度為98%)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、HAT選擇性培養(yǎng)基、HEPES和50%PEG購(gòu)自美國(guó)sigma公司;四季清胎牛血清為長(zhǎng)春寶泰克生物制品有限公司產(chǎn)品;PRM I-1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;小鼠單抗亞類鑒定試劑盒購(gòu)自洛陽(yáng)賽爾維公司;8周齡雌性健康BALB/c小鼠購(gòu)自吉林省長(zhǎng)春市生物制品所,本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng);小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0,由本室保存;其他試劑均為分析純。

BIO-RAD Model680酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(USA);二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO);倒置顯微鏡(Olympus);AKTA purifier100(GE);1mL的A蛋白層析柱(上海悅克生物技術(shù)有限公司);離心機(jī)(科大中佳公司);移液器(Thermo);96孔酶標(biāo)板(JET);96孔、24孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Costar公司)。

1.2 動(dòng)物免疫

β-酪蛋白的分子量為24000,屬于大分子物質(zhì),因此可以直接刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。免疫方案如下:本試驗(yàn)采用足墊免疫方法,首次免疫用β-酪蛋白(1μg/mL)與弗氏完全佐劑各200μL乳化后免疫6-8周齡BALB/c小鼠3只,每只注射50μL;一周后第二次免疫,用β-酪蛋白(1μg/mL)與弗氏不完全佐劑各200μL乳化后注射,每只50μL;一周后再進(jìn)行第三次免疫,劑量與方法同第二次免疫;第三次免疫后一周檢測(cè)小鼠血清效價(jià),融合前3天用不加佐劑的β-酪蛋白抗原腹腔注射加強(qiáng)免疫,50μg/只。

1.3 血清效價(jià)檢測(cè)

小鼠斷尾進(jìn)行尾尖采血,4℃,3 000 r/min離心5min,取上清。利用間接 ELISA方法檢測(cè)血清效價(jià),同時(shí)設(shè)陰性和空白對(duì)照,選取血清效價(jià)大于8 000的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.4 細(xì)胞融合

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠的脾細(xì)胞以1∶5-1∶10混合,1 000 r/min,離心4min,棄上清,用手指輕彈離心管底部,敲散細(xì)胞團(tuán)以使細(xì)胞均勻松散,40℃水浴1 min,左手緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)離心管,右手用移液器沿轉(zhuǎn)動(dòng)的管壁緩緩加入1 mL 37℃預(yù)熱的50%的PEG1000,加入PEG后再水浴30 s,然后立即加入PRM I-1640培養(yǎng)基,1 min內(nèi)加入3 mL,最后加到50 mL,800 r/min離心4 min后棄上清,加入含20%血清的1640培養(yǎng)液少許,把細(xì)胞吹起倒入盛有50mL 20%血清1640培養(yǎng)液的平皿中,再向其中加入37℃預(yù)熱的HAT 1mL,混勻后鋪于事先鋪有飼養(yǎng)層的4塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔120 μL。最后將細(xì)胞培養(yǎng)板用酒精棉擦凈,放入37℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選與亞克隆

融合5-6天后觀察融合效果并換液,待細(xì)胞長(zhǎng)到細(xì)胞培養(yǎng)孔體積的1/10時(shí),用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液,選擇陽(yáng)性值高且細(xì)胞堆數(shù)目少的孔通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,每次克隆使每個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目理論值為1-2個(gè),經(jīng)過(guò)3-4次亞克隆后,雜交瘤陽(yáng)性達(dá)100%,即可獲得能夠穩(wěn)定分泌β-酪蛋白抗體的細(xì)胞株,將此細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后一部分用于下面的單克隆抗體的生產(chǎn),一部分放入液氮罐內(nèi)凍存。

1.6 單克隆抗體的生產(chǎn)

采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法生產(chǎn)單克隆抗體,7只8-10周齡雌性Bablc小鼠,先腹腔注射無(wú)菌石蠟油,每只0.5 mL,一周后向腹腔內(nèi)注入雜交瘤細(xì)胞,每只小鼠大約注射106個(gè)細(xì)胞,8-10天后即開始采集腹水。

1.7 單克隆抗體的亞類鑒定

利用小鼠單抗亞類鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的亞類類型,方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.8 單克隆抗體的純化

應(yīng)用Protein A親和層析法純化單克隆抗體,利用AKTA explorerl00進(jìn)行監(jiān)測(cè)。首先取腹水,在4℃,12 000 r/min條件下離心30 min,以除去較大的凝塊,再用0.22μm的濾器過(guò)濾;用磷酸鹽緩沖液pH7.0(A液)流洗平衡柱子,流速為1 mL/min;取預(yù)處理過(guò)的腹水10mL,每次上樣700-800μL,流速為1mL/min;用上樣緩沖液進(jìn)行流洗,10倍柱床體積,流速為1mL/min;隨后用0.02M,Ph4.0的檸檬酸緩沖液(B液)洗脫抗體,同時(shí)應(yīng)用AKTA exp Iorerl00進(jìn)行監(jiān)測(cè),并用干凈的玻璃管收集,玻璃管內(nèi)事先加入計(jì)算好的1M pH 9.0的Tris—Hcl緩沖液使pH值至7.0,以防洗脫下來(lái)的蛋白變性;當(dāng)洗脫峰回到基線后,繼續(xù)用上樣緩沖液平衡5-10倍柱床體積,流速仍為1 mL/min。

1.9 腹水效價(jià)的測(cè)定

用1μg/mL的β-酪蛋白包被 ELISA酶標(biāo)板,用ELISA方法檢測(cè)未純化及純化腹水的抗體效價(jià)。以陽(yáng)性值與陰性值的比值大于2.0的最大抗體稀釋倍數(shù)定為抗體效價(jià)。

1.10 單抗親和力的測(cè)定

采用非競(jìng)爭(zhēng)性間接ELISA方法來(lái)測(cè)定抗體親和力 ,抗原β-酪蛋白的包被濃度分別為 3、2、1.5、1、0.5、0.25、0μg/mL,100μL/孔 ,4℃過(guò)夜 ,每孔加入 100 μL 0.1M NH4Cl封閉液,將單抗從4 000倍開始倍比稀釋,在同一個(gè)坐標(biāo)系內(nèi),以抗體濃度(mol/L)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以其相對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo),做出反應(yīng)曲線,找出各條曲線的ODmax和50%ODmax所對(duì)應(yīng)的抗體濃度。根據(jù)公式計(jì)算出該株單抗的親和常數(shù)[6]。

注:n為每組中兩個(gè)包被濃度的倍數(shù),[Ab‘]t和[Ab]t分別為每組中兩個(gè)50%ODmax所對(duì)應(yīng)的抗體濃度。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性雜交瘤的篩選與克隆

融合5-6天后計(jì)算融合率,本次試驗(yàn)融合率為71.9%。利用間接ELISA和有限稀釋法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)過(guò)3-4次亞克隆后,獲得了一株能夠穩(wěn)定分泌β-酪蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株,將其命名為4H1。

2.2 單抗亞類鑒定

經(jīng)小鼠單抗亞類鑒定試劑盒鑒定,雜交瘤細(xì)胞株4H1分泌的抗體亞類為IgG2a。

2.3 蛋白A層析柱純化腹水

利用Protein A親和層析法純化腹水,利用AKTA explorerl00進(jìn)行監(jiān)測(cè),結(jié)果顯示雜蛋白峰值很高,只有一個(gè)目的蛋白峰,目的蛋白與雜蛋白得到很好的分離,結(jié)果如圖2.1所示。

2.4 腹水純化的SDS-PAGE鑒定

經(jīng)SDS-PAGE電泳后結(jié)果如圖2.2所示,20倍稀釋的未純化腹水SDS-PAGE結(jié)果為多條帶,同樣倍數(shù)稀釋的純化后的腹水IgG2a只有兩條帶,分別為IgG2a的重鏈(50 KD)和輕鏈(26 KD),證明蛋白A層析柱純化效果較好。

2.5 單抗親和力的測(cè)定

經(jīng)A蛋白層析柱純化后的腹水效價(jià)為2.56×106,采用非競(jìng)爭(zhēng)間接ELISA方法測(cè)定單克隆抗體的親和力,其親和常數(shù)為5.29×108mol/L,結(jié)果如圖2.3。

3 討論

3.1 免疫方法

圖2.1 腹水純化的蛋白A層析圖

圖2.2 腹水純化SDS-PAGE圖

圖2.3 單抗親和力

生產(chǎn)單克隆抗體的常規(guī)免疫方法是腹腔注射免疫原,免疫劑量為每只小鼠100μg,每隔2周免疫一次,經(jīng)2-3次免疫后取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,常規(guī)免疫方法的缺點(diǎn)是免疫劑量大、免疫周期長(zhǎng)。本試驗(yàn)采用足墊免疫,免疫劑量為每只小鼠50 μg,免疫間隔為1周,與常規(guī)免疫相比足墊免疫有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)[7]:一是免疫劑量小,尤其是對(duì)價(jià)格昂貴的免疫原來(lái)說(shuō)這一優(yōu)勢(shì)更加明顯;二是免疫周期短,縮短了β-casein單克隆抗體的生產(chǎn)周期。

3.2 影響細(xì)胞融合的關(guān)鍵因素

影響細(xì)胞融合的因素有很多,但最關(guān)鍵的因素是SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的狀態(tài)、PEG的作用時(shí)間與PEG分子量的大小。首先,要選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞;其次,PEG的作用時(shí)間不要超過(guò)2分鐘,并且PEG的分子量不要太大,一般為 PEG1000-1500,PEG分子量越大,對(duì)細(xì)胞的毒害作用越大。而且盡量縮短PEG的作用時(shí)間也是為了減小PEG對(duì)細(xì)胞的毒害作用。此外,融合時(shí)的水浴溫度一般為38-39℃,離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為800-1 000 r/min,這些都是影響此本次試驗(yàn)融合率(71.9%)的因素。

3.3 單克隆抗體的純化

采用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的小鼠單克隆抗體免疫球蛋白的類型有 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和 IgM。一般初次免疫應(yīng)答主要是誘導(dǎo)產(chǎn)生IgM分子,對(duì)抗原的結(jié)合力低,為低親和性抗體,而再次免疫應(yīng)答后主要產(chǎn)生高親和性抗體IgG類分子,本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)多次免疫后得到高親和性IgG2a型抗體。目前,單克隆抗體的純化方法有很多,如辛酸—硫酸銨法[8]、離子交換層析[9]、親和層析[10]、疏水層析、凝膠過(guò)濾法及高壓液相層析法等。本試驗(yàn)采用A蛋白層析柱純化單克隆抗體,純化后單抗腹水抗體效價(jià)達(dá)2.56×106,純化效果較好。

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