金 燦 潘紅春

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重要生物資源保護與利用研究安徽省重點實驗室,生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室,蕪湖 241000)

水螅芽體發(fā)育與頭部再生進程間的相互作用

金 燦 潘紅春

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重要生物資源保護與利用研究安徽省重點實驗室,生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室,蕪湖 241000)

目的 觀察具有單個芽體的大乳頭水螅(Hydra magnipapillata)頭部再生進程,探討水螅頭部結(jié)構(gòu)的再生進程與芽體發(fā)育過程之間可能存在的相互作用。方法 選取具有單個年幼芽體的水螅體,在水螅母體上緊貼芽體著生部位的上方進行切除手術(shù),觀察母體頭部再生進程。通過ABTS細胞化學(xué)染色法檢測水?；P分子標志物過氧化物酶的表達,觀察水螅芽體基盤與母體間的結(jié)構(gòu)聯(lián)系。結(jié)果 水螅母體傷口在手術(shù)后2h內(nèi)愈合。隨著再生時間的延長,出現(xiàn)兩種不同命運的芽體發(fā)育方式。一種情況是水螅芽體基盤緊貼母體手術(shù)切口,芽體發(fā)育成熟后可正常脫離母體;在芽體脫離母體前母體頭部再生進程被抑制,在芽體脫落后母體頭部再生進程重新啟動、且在其后48h內(nèi)母體頭部再生完成。另一種情況是水螅芽體基盤組織與母體手術(shù)切口不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)聯(lián)系而向外突出生長,母體頭部再生進程完全停止,芽體胃區(qū)與母體相連且芽體發(fā)育成熟后不脫離母體。結(jié)論 靠近水螅母體手術(shù)傷口的年幼芽體能延遲或阻斷母體頭部的再生進程,而手術(shù)切口也可能干擾了發(fā)育成熟的芽體與母體脫離的正常機制。

大乳頭水螅; 無性出芽生殖; 再生; 基盤過氧化物酶

刺胞動物門水螅綱的淡水水螅是非常適合進行個體發(fā)育和形態(tài)發(fā)生調(diào)控機制研究的模式生物,主要基于兩個方面的因素:一是水螅為低等的兩胚層動物;二是因為水螅具有簡單的單個體軸的極性體制,一個極為由口、垂唇和口周圍的數(shù)根觸手組成的口區(qū),另一極為由柄和位于身體末端的基盤構(gòu)成的足區(qū),口區(qū)和足區(qū)之間為胃區(qū),其中胃區(qū)與柄的分界處為出芽區(qū)。水螅具有有性和無性兩種繁殖方式,在實驗室培養(yǎng)條件下,水螅通常以無性繁殖的方式在出芽區(qū)產(chǎn)生芽體,發(fā)育成熟的芽體脫離母體后成為新生水螅體。已有研究表明,水螅出芽率由喂食頻率決定,喂食次數(shù)越多,出芽數(shù)量越多[1,2]。水螅芽體的最初發(fā)生誘因及影響芽體發(fā)育速度的主要因子均為喂食頻率,但芽體發(fā)育成熟后脫離母體的調(diào)控機制尚不清楚。

有研究發(fā)現(xiàn)佛波醇、甘油二酯及氯化鋰等物質(zhì)能阻止水螅芽體基盤的形成,芽體不能脫離母體、而成為與母體相連的身體分支[3-6];培養(yǎng)液中鈣離子濃度偏低或在培養(yǎng)液中添加鋇離子或鍶離子亦能阻止芽體與母體脫離[7]。上述研究結(jié)果說明水螅芽體與母體的分離能受到外界因素的干擾,對從側(cè)面探討水螅芽體脫離母體的調(diào)控機制有所幫助,但從水螅體本身研究芽體從母體脫落的調(diào)控機制尚未見報道?；诖?本文為探討手術(shù)切口對水螅芽體發(fā)育進程的影響,選取具有單個年幼芽體的水螅體,在水螅母體上緊貼芽體著生部位的上方進行切除手術(shù),觀察芽體發(fā)育及母體頭部再生進程,探討水螅母體頭部再生進程與芽體形成過程之間可能存在的相互作用。

材料和方法

1 實驗材料

實驗用水螅為本實驗室培育的大乳頭水螅(Hy dra magnipapillata)單克隆無性繁殖系,原種采自安徽省蕪湖市汀堂公園水塘(31021’39.2”N,118022’51.46”E)。實驗前水螅每 3d 喂食一次鹵蟲幼體(A rtemiasp.),喂食1h后更換培養(yǎng)液,然后維持在溫度22±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中(光照強度=2000LX,LD:HD=12h:12h)。

2 實驗方法

2.1 水螅的切斷手術(shù)

實驗組選取100只具有單個年幼芽體(芽體未長觸手,第 4-5階段的芽體[1,8])的成體水螅(圖1A),用單面刀片緊貼水螅芽體著生部位的上方進行切斷手術(shù),將水螅切成前、后兩段(圖1B)。手術(shù)后的水螅后段放入裝有水螅培養(yǎng)液的小燒杯中,并置于22±0.5℃的黑暗培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

對照組挑取100只無芽體水螅(圖1C),用單面刀片在水螅胃區(qū)和水螅柄的分界處(出芽區(qū))進行切斷手術(shù)將水螅切成前、后兩段(圖1D),對照組的后續(xù)處理同實驗組。

圖1 實驗組大乳頭水螅頭部切斷手術(shù)前(A,10X)、后(B,10X)個體形態(tài)及對照組無芽體水螅切斷手術(shù)前(C,10X)、后(D,10X)個體形態(tài).示觸手(T),口(M),芽體(BU),出芽區(qū)(BR),基盤(BD),切口部位(AS),胃區(qū)(GC)及水螅柄(PE)Fig.1 The normal polyp bearing a young bud(A,10X),the polyp which was sectioned just apical to the bud(B,10X),the normal hydra body without any bud(C,10X)and the polyp which was cut just at the budding region(D,10X).Tentacle(T),mouth(M),bud(BU),budding region(BR),basal disc(BD),amputation section(AS),gastral cavity(GC)and peduncle(PE)

2.2 水螅頭部再生及芽體發(fā)育過程觀察

分別在切斷手術(shù)之后的 0h、4h、8h、16h、24h 觀察由切斷手術(shù)得到的水螅后段再生頭部的進程以及芽體發(fā)育進程,之后每24h觀察一次。每次觀察時拍照記錄并更換水螅培養(yǎng)液。

2.3 基盤分子標志物基盤過氧化物酶表達的檢測

通過ABTS細胞化學(xué)染色法檢測水螅基盤分子標志物過氧化物酶的表達,觀察水螅芽體基盤與母體間的結(jié)構(gòu)聯(lián)系。將水螅置于白色陶瓷比色板上(每孔1只水螅),每孔分別加入350 l新鮮配制的ABTS染色混合液(655mmol/L檸檬酸、345mmol/L檸檬酸鹽和1%ABTS溶液各700l,70l 0.3%H2O2,雙蒸水定容至7ml)[9-11],反應(yīng)20min后用雙蒸水洗滌2次,加入300l 2%NaF溶液,然后通過Olympus數(shù)碼顯微鏡觀察和拍照。

結(jié) 果

1 水螅芽體發(fā)育進程與頭部再生進程

所有實驗組水螅母體的傷口在手術(shù)后2h內(nèi)均可愈合,隨著再生時間的延長,出現(xiàn)兩種不同命運的芽體發(fā)育方式。一種命運是水螅芽體基盤緊貼母體手術(shù)切口,芽體發(fā)育成熟后可正常脫離母體;另一種命運是水螅芽體基盤組織與母體手術(shù)切口不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)聯(lián)系而向外突出生長,母體頭部再生進程完全停止,芽體胃腔與母體相連且芽體發(fā)育成熟后不脫離母體(表1)。

表1 切斷手術(shù)后芽體發(fā)育的兩種命運Table 1 Two types of development fates of the bud after amputation

1.1 芽體發(fā)育命運之一:芽體發(fā)育成熟后可正常脫離母體、但脫離母體前抑制母體頭部再生進程

實驗組水螅切斷手術(shù)后,隨著再生時間的延長,母體切口逐漸愈合(圖2B),再生48h時已可以看到芽體與母體連接處出現(xiàn)較淺縊痕(圖2F),從基盤分子標志物過氧化物酶的表達區(qū)域可以清楚地看出芽體的基盤組織與母體直接接觸(圖3),72h時縊痕明顯、芽體基盤著生于母體切口處且芽體即將脫離母體(圖2G),芽體發(fā)育96h后脫離母體,母體在芽體脫落后48h時母體頭部再生完成,也就是說實驗組水螅自切斷手術(shù)后144h才完成頭部再生。而對照組水螅自切斷手術(shù)后48h之內(nèi)頭部再生就已經(jīng)完成(圖4)。

圖2 切斷手術(shù)后芽體最終要與母體分離、但芽體與母體分離前母體頭部的再生進程被抑制的水螅個體的形態(tài)學(xué)變化.0h(A,8X),4h(B,8X),8h(C,8X),16h(D,8X),24h(E,8X),48h(F,8X),72h(G,8X),96h(H,8X),144h(I,8X),手術(shù)切口(AS),芽體 (BU),觸手 (TE),基盤 (BD),水螅母體 (PP),縊痕 (CO)Fig.2 The morphological change of the cut parent polyps of which the head regeneration process was inhibited before the bud detaching.0h(A,8X),4h(B,8X),8h(C,8X),16 h(D,8X),24 h(E,8X),48 h(F,8X),72 h(G,8X),96 h(H,8X),144 h(I,8X),amputation section(AS),bud(BU),tentacle(TE),basal disc(BD),the parent polyp(PP)and constriction(CO)

圖3 切斷手術(shù)后最終要脫離母體的芽體與母體切口處的連接方式(A,30X)以及芽體和母體各自基盤過氧化物酶的表達(B,20X;C,80X).示切口部位(AS),芽體基盤(BBD),芽體基盤過氧化物酶的表達區(qū)域(BBP),母體基盤過氧化物酶的表達區(qū)域(BP),水螅母體(PP),芽體(BU),縊痕(CO)Fig.3 Structural connection between the bud’s basal disc(A,30X)and the parent polyp,and the expression of peroxidase in the bud’s basal disc and the parent polyp’s basal disc(B,20X;C,80X). Amputation section(AS),the basal disc of bud(BBD),the expression of peroxidase in the basal disc of bud(BBP),the expression of peroxidase in the basal disc of parent polyp(BP),the parent polyp(PP),bud(BU),constriction(CO)

圖4 無芽體水螅切斷手術(shù)后頭部再生進程.每張圖右上角插圖為各再生時間段水螅的切口部位放大圖,0h(A,8X),4h(B,8X),8h(C,8X),16h(D,8X),24h(E,8X),48h(F,8X),手術(shù)切口(AS),基盤(BD),觸手(TE)Fig.4 The head regeneration process of budless hydra body after amputation. The illustration in the right upper corner of every figure is the enlarged view of hydra’s amputation section,0h(A,8X),4h(B,8X),8h(C,8X),16h(D,8X),24h(E,8X),48h(F,8X),amputation section(AS),basal disc(BD),tentacle(TE)

1.2 芽體發(fā)育命運之二:芽體胃區(qū)與母體相連且芽體發(fā)育成熟后不脫離母體

實驗組水螅2h內(nèi)傷口愈合,芽體朝向手術(shù)切口方向彎曲生長(圖5A-E),切斷手術(shù)48h時芽體長出基盤組織(圖5F),96h芽體基盤形狀明顯并向外突出生長于母體外(圖5H),從基盤分子標志物過氧化物酶的表達區(qū)域可以清楚地看出芽體的基盤組織與母體出芽區(qū)域不直接接觸(圖6),芽體的胃區(qū)與水螅母體相連,整體呈倒“Y”形(圖5J-L),芽體發(fā)育成熟后與母體相連不脫落,母體本身頭部的再生進程完全停止。

2 倒“Y”形水螅喂食前后胃腔狀態(tài)及出芽過程

對倒“Y”形水螅連續(xù)觀察并于切斷手術(shù)后的168h開始喂食,由于鹵蟲無節(jié)幼蟲體色為淡黃色,可根據(jù)水螅胃腔顏色明顯觀察到兩個胃腔均有消化能力,表明芽體胃腔與原母體胃腔相通(圖7)。

由于喂食,倒“Y”形水螅開始出現(xiàn)第一代芽體,72h后芽體發(fā)育成熟脫落。第一代芽體出芽部位為原水螅母體出芽區(qū),并著生于母體出芽區(qū)外側(cè),第一代芽體發(fā)育成熟后正常脫離母體,表明原芽體已經(jīng)與母體形成一個整體(圖8)。

圖5 切斷手術(shù)后母體頭部的再生被完全抑制、同時芽體不與母體分離的水螅個體的形態(tài)學(xué)變化.0h(A,15X),4h(B,15X),8h(C,15X),16h(D,15X),24h(E,15X),48h(F,15X),72h(G,15X),96h(H,15X),144h(I,10X),168h(J,10X),192h(K,10X),216h(L,10X),手術(shù)切口(AS),芽體(BU),母體基盤(BD),觸手(TE),芽體基盤(BBD),水螅母體(PP)Fig.5 The morphological change of the cut parent polyps of which the head regeneration process was inhibited completely.0h(A,15X),4h(B,15X),8h(C,15X),16h(D,15X),24h(E,15X),48h(F,15X),72h(G,15X),96h(H,15X),144h(I,10X),168h(J,10X),192h(K,10X),216h(L,10X),amputation section(AS),bud(BU),the basal disc of parent polyp(BD),tentacle(TE),the basal disc of bud(BBD)and the parent polyp(PP)

圖6 切斷手術(shù)后最終不與母體脫離的芽體與母體切口處的連接方式(A:切除手術(shù)后72h,40X;C:切除手術(shù)后96h,30X)以及芽體和母體各自基盤過氧化物酶的表達(B:切除手術(shù)后72h,20X;D:切除手術(shù)后96h,20X).手術(shù)切口(AS),芽體基盤(BBD),芽體基盤過氧化物酶的表達區(qū)域(BBP),母體基盤過氧化物酶的表達區(qū)域(BP),水螅母體(PP),芽體(BU)Fig.6 Structural connection between the bud’s basal disc and the parent polyp(A:72h after amputation,40X;C:96h after amputation,30X),and the expression of peroxidase in the bud’s basal disc and the parent polyp’s basal disc(B:72h after amputation,20X;D:96h after amputation,20X).Amputation section(AS),the basal disc of bud(BBD),the basal disc of parent polyp(BD),the expression of peroxidase in the basal disc of bud(BBP),the expression of peroxidase in the basal disc of parent polyp(BP),bud(BU)

圖7 倒“Y”形水螅喂食前后胃腔狀態(tài).喂食前(A,10X),喂食后30min(B,10X),喂食后1h(C,10X),喂食后24h(D,10X).示鹵蟲(AR),芽體(BU),母體基盤(BD),芽體基盤(BBD),水螅母體(PP)Fig.7 The gastral cavity of the inverted Y-shaped hydra before and after feeding. Before feeding(A,10X),30 min after feeding(B,10X),1 h after feeding(C,10X),24 h after feeding(D,10X),A rtemiasp.(AR),bud(BU),the basal disc of parent polyp(BD),the basal disc of bud(BBD)and the parent polyp(PP)

圖8 倒“Y”形水螅第一代芽體的發(fā)育過程.階段1芽體(A,10X),階段6芽體(B,10X),階段8芽體(C,10X),芽體脫離母體(D,10X),第一代芽體(NBU),芽體(BU),母體基盤(BD),芽體基盤(BBD),水螅母體(PP),第一代芽體脫離母體形成的新生水螅個體(NH)Fig.8 The formation process of first-generation bud in the inverted Y-shaped hydra. stage 1 bud(A,10X),stage 6 bud(B,10X),stage 8 bud(C,10X),parent polyp and a detached bud(D,10X),first-generation bud(NBU),bud(BU),the basal disc of parent polyp(BD),the basal disc of bud(BBD),the parent polyp(PP)and new hydra body(NH)

討 論

水螅進行無性出芽生殖時其出芽區(qū)體壁向外形成芽突,芽突長度逐漸增加(芽突的胃腔與母體是相通的),直至其尖端出現(xiàn)垂唇和觸手而成為成形的芽體,隨后芽體與母體的連接部位體壁出現(xiàn)縊縮而隔斷芽體胃腔與母體胃腔,最后發(fā)育成熟的水螅芽體脫離母體成為新生水螅體[1]。本研究在水螅母體上緊貼芽體著生部位的上方進行切除手術(shù)后,出現(xiàn)兩種不同命運的芽體發(fā)育方式。一種情況是水螅芽體基盤緊貼母體手術(shù)切口,芽體發(fā)育成熟后可正常脫離母體(圖2);另一種情況是水螅芽體基盤組織與母體手術(shù)切口不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)聯(lián)系而向外突出生長,芽體胃區(qū)與母體相連且芽體發(fā)育成熟后不脫離母體而形成倒“Y”形水螅體(具有2個基盤和1個頭的水螅體,圖5L)。上述研究結(jié)果顯示芽體能夠脫離母體水螅的先決條件是芽體與母體直接接觸的部位外胚層細胞要分化成能高量表達基盤特異性過氧化物酶的粘液細胞,即芽體與母體直接接觸的部位要分化成基盤組織。另外 Zeretzke等[7]采用鈣離子濃度偏低的培養(yǎng)液成功阻止水螅芽體與母體正常分離而誘導(dǎo)出“H”形水螅個體(具有2個基盤和2個頭的水螅體,芽體的基盤不直接與母體接觸而向外突出)和“Y”形水螅個體(具有1個基盤和2個頭的水螅體,芽體與母體直接接觸的部位沒有分化出基盤組織)的相關(guān)實驗也證實了這一判斷。以上幾種水螅芽體與母體不脫離的畸形水螅個體有一個共性,就是芽體與母體直接接觸部位無特殊細胞分化、而與該處母體組織是均一性組織,因而可能難以產(chǎn)生芽體脫離母體的調(diào)控信號。還有一種可能性也值得考慮,正常情況下水螅進行無性出芽生殖時芽體發(fā)育成熟后必然要脫離母體,然而本實驗在緊貼芽體上方的位置進行切除手術(shù)造成了大部分水螅個體的成熟芽體不能正常脫離母體(圖5),因此有可能是這個特殊位置的手術(shù)切口干擾了發(fā)育成熟的芽體與母體脫離的正常機制。

本文實驗結(jié)果表明,在母體頭部的再生進程中,切口附近芽體的存在抑制了母體頭部的再生進程,表現(xiàn)為母體頭部再生進程的延遲(芽體脫落后,頭部再生進程才開始啟動,圖2)或母體頭部再生進程的完全停止(倒“Y”形水螅體,圖5)。一般認為水螅體內(nèi)存在4種成形素(頭部形成抑制物,頭部形成激活物,基盤形成抑制物和基盤形成激活物)調(diào)控其頭部和基盤的形成,這4種物質(zhì)順水螅體軸按濃度梯度分布,頭部形成抑制物和頭部形成激活物在水螅體頭部濃度最大,而基盤形成抑制物和基盤形成激活物濃度在基盤位置最大[12,13]。依照該理論,在水螅芽體的發(fā)育過程中,在水螅芽體與母體接觸的區(qū)域應(yīng)該分布大量基盤形成激活物;而本研究中緊貼芽體上方的手術(shù)切口(此切口應(yīng)該再生母體頭部)的再生進程受到抑制或阻斷,似乎該處頭部形成抑制物應(yīng)該高表達,所以從這點推斷,水螅芽體基盤區(qū)域的基盤形成激活物會不會與頭部形成抑制物是同一物質(zhì)呢?還有待進一步研究。

[1]Fischer AB,Hofmann DK.Budding bud morphogenesis,and regeneration inCarybdea marsupialisLinnaeus,1758(Cnidaria:Cubozoa). Hydrobiologia,2004,530/531:331-337

[2]Dunn KW.The effect of host feeding on the contribution of endosymbiotic algae to the growth of green hydra.Biol Bul.,1988,175:193-201

[3]P′erez F. Effects of cantharidin and phorbol ester on bud formation in Hydra vulgaris. Int J Dev Biol,1996,suppl.1:273

[4]Müller WA. Diacylglycerol induced multiple head formation inHydra.Development,1989,105:309-316

[5]Müller WA. Ectopic head and foot formation inHydra:Diacylglycerol induced increase in positional value and assistance of the head in foot formation.Differentiation,1990,42:131-143

[6]Hassel M,Berking S.Lithium ions interfere with pattern control inHydra vulgaris. Roux′s Arch Dev Biol,1990,198:382-388

[7]Zeretzke S,Pérez F,Velden K,et al. Ca2+-ions and pattern control in Hydra.Int J Dev Biol,2002,46:705-710

[8]Joann JO,Campbell RD.Budding inHydra attenuata:bud stages and fate map.Journal of Experimental Zoology,2005,200(3):417-428

[9]徐金金,潘紅春,金燦等.大乳頭水螅基盤再生進程中過氧化物酶的表達.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,2010,19(3):269-273

[10]Sabine H,Schaller HC.A new biochemical marker for foot-specific cell differentiation in hydra. Roux’s Dev Biol,1985,194:453-461

[11]Ghaskadbi SS,Shetye L,Chiplonkar S,et al.Ultraviolet irradiation initiates ectopic foot formation in regenerating hydra and promotes budding.Biosci,2005,30(2):177-182

[12]Kukalev AS. Morphogens of hydraHydrasp. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology,2005,41(1):1-11

[13]Shostak S. Bipolar inhibitory gradients’influence on the budding region ofHydra viridis.Amer Zoo,1974,14:619-632

Interaction Between Bud Development And Head Regeneration Process In Hydra

Jin Can,Pan Hongchun＊

(Provincial Key L aboratory of the Conservation and Ex ploitation of Biological Resources&Provincial Key L aboratory of Biotic Environment and Ecological S af ety in A nhui,College of L if e Sciences,A nhui Normal University,W uhu241000China)

Objective To observe the head regeneration process inHy dra magnipapillatawith a single bud and explore the possible interplay between head regeneration and bud development.Methods The hydra polyps bearing a young bud were sectioned just apical to the bud for observing the head regeneration process of the parent polyps. In order to observe the structural connections between the bud’s basal disc and the parent polyp,the cytochemical staining method based on substrate ABTS was used to reveal the expression of the peroxidase in the basal disc.Results The amputation wounds healed in two hours,and there were subsequently two different developmental patterns of the bud:(1)The bud whose basal disc contacted directly with the amputation wound would detach from the parent polyp.However,the head regeneration process in the parent polyp was suspended before the bud detachment then restart and beaccomplished in about 48 hours;and(2)The bud whose gastral region rather than the basal disc contacted directly with the parent polyp’s amputation did not detach from the parent polyp when the bud was fully formed,while the basal disc of the bud grew outside the parent polyp.In addition,the head regeneration process in the parent animal was inhibited completely.Conclusion The young bud near the amputation wound of the parent polyp suspends or prohibis the head regeneration of the parent hydra,and the amputation section may interfere with the mechanism by which the bud separates from the parent polyp.

Hy dra magnipapillata; Asexual reproduction by budding; Regeneration; Peroxidase of basal disc

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.019

2010-10-25

2010-12-29

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究重點項目(KJ2011A130);安徽師范大學(xué)生物大分子進化重點實驗室開放基金項目(2006A002);安徽省優(yōu)秀青年基金資助項目(08040106811)

金燦,男(1984年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)