石萌萌，王 嘉，謝 瑤

(北京東方紅航天生物技術(shù)股份有限公司，北京 100190)

高效液相色譜法測定表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量

石萌萌，王 嘉，謝 瑤*

(北京東方紅航天生物技術(shù)股份有限公司，北京 100190)

建立了一種利用高效液相色譜法(HPLC)測定綠茶提取物原料中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量的方法。通過對流動相組成、色譜柱、流速及溫度等色譜條件的選擇及優(yōu)化，得到了適合EGCG檢測的色譜條件:色譜柱TSK－GEL?ODS－100V，流動相組成甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2的，流速1.0mL/min，檢測波長276nm，柱溫24℃。實驗結(jié)果表明，EGCG在含有咖啡因及與EGCG類似物質(zhì)的復(fù)雜體系中被快速、高效地檢出。同時，該方法操作簡單，檢測效率高，重現(xiàn)性好，可以有效地節(jié)約實驗成本，進(jìn)一步證明了該方法可行性。在實際測定中，可以實現(xiàn)原料檢測工作的快速、高效運行，適合企業(yè)對綠茶提取物原料中EGCG的質(zhì)量控制。

綠茶提取物，EGCG，HPLC，測定，質(zhì)量控制

飲茶在我國擁有悠久的歷史，茶葉中的多酚對健康極為有利，它是茶葉中兒茶素類、丙酮類、酚酸類和花色素類化合物的總稱。兒茶素類主要包括:表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子酸兒茶素沒食子酸酯(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)及表兒茶素(EC)。其中EGCG的含量最高，約占兒茶素總量的50%［1－2］。EGCG是一種抗氧化和清除自由基功能很強的活性物質(zhì)，已作為一種抗癌新藥成為現(xiàn)今科研和產(chǎn)品開發(fā)的熱點［3］。它的抗氧化活性是VE的20倍、SOD的6倍［4］，具有明顯的清除體內(nèi)自由基、抗癌、抗炎、抗突變、抗衰老及改善肝功能等生物活性［4］。研究表明，EGCG能較全面地調(diào)節(jié)血脂，一方面，通過其自身的強抗氧化活性控制膽固醇的氧化，抑制脂質(zhì)物在血管壁沉積;另一方面，抑制食物中不飽和脂肪酸的氧化，從而減少血清膽固醇含量及保持脂質(zhì)在動脈壁的進(jìn)入和移出的正常動態(tài)平衡［5］。目前，EGCG的檢測方法主要包括容量法、比色法及原子吸收法［3］，但大多存在儀器要求復(fù)雜、靈敏度低等缺點。由于高效液相色譜技術(shù)具有分辨率高、分析速度快、重復(fù)性好、自動化程度高等優(yōu)點，在食品原料檢測方面已成為了重要的分析手段［8］。已報道的EGCG分離、純化、制備的文獻(xiàn)中涉及的一些檢測方法［3，6－7］，大多未考慮EGCG與咖啡因的分離，但目前在保健食品中應(yīng)用的綠茶提取物原料中，咖啡因含量對產(chǎn)品的質(zhì)量控制非常重要，因此EGCG與咖啡因的分離尤為重要［1，16］。針對以上情況，本文對色譜條件進(jìn)行了選擇及優(yōu)化，建立了簡單、快速、準(zhǔn)確檢測綠茶提取物中EGCG的方法，適用于企業(yè)對綠茶提取物原料的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇 fisher公司，色譜純;超純水 屈臣氏;乙酸 北京化學(xué)試劑公司，分析純;EGCG標(biāo)準(zhǔn)品 杭州禾田生物技術(shù)有限公司，純度＞99%;綠茶提取物 福州日冕科技開發(fā)有限公司。

高效液相色譜儀 配有996紫外檢測器，515泵及M32色譜工作站，美國Waters公司;TSK－GEL? ODS－100V色譜柱 C18，3μm，4.6×150mm，東曹達(dá)(上海)貿(mào)易有限公司;BS210S型電子分析天平 德國Sartorius公司;LDZ4－0.8型醫(yī)用離心機 北京醫(yī)用離心機廠;KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;FW80型高速萬能粉碎機 蘇州江東精密儀器有限公司;SHB－IIIA型真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 樣品制備 取綠茶提取物原料，準(zhǔn)確稱取約0.1g，加一定量純水溶解，再定容至100mL容量瓶中，備用。

1.2.1.2 對照品制備 準(zhǔn)確稱取 EGCG對照品20.0mg，加一定量純水溶解，再定容至50mL的容量瓶中，備用。

1.2.2 色譜條件的選擇 分別精密吸取對照品與供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，測定樣品中EGCG的含量。

1.2.2.1 流動相組成的優(yōu)化 在色譜柱為 Kromasil C18(5μm，4.6mm×150mm);進(jìn)樣量為20μL;檢測波長為276nm;流速為1.0mL/min;柱溫為室溫的條件下，分別采用甲醇∶水∶乙酸(20∶79∶1)、甲醇∶水∶乙酸(28∶71∶1)、甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)、甲醇∶水∶乙酸(18∶80∶2)、甲醇∶水∶乙酸(20∶78∶2)的不同流動相進(jìn)行測定。

1.2.2.2 色譜柱的優(yōu)化 在流動相采用甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)，進(jìn)樣量為20μL，檢測波長為276nm，流速為1.0mL/min，室溫條件下，分別采用色譜柱Kromasil C18(5μm，4.6mm×150mm)、Kromasil C18(5μm，4.6mm ×250mm)、Inertail ODS－4 C18(5μm，4.6mm × 250mm)、TSK－GEL? ODS－100V(3μm，4.6 mm× 150mm)進(jìn)行測定。

1.2.2.3 流速的優(yōu)化 在色譜柱為TSK－GEL? ODS－100V(3μm，4.6 mm×150mm)，流動相為甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)，進(jìn)樣量為20μL，檢測波長為276nm，室溫條件下，分別在1.0、0.9、0.8mL/min流速下進(jìn)行測定。

1.2.2.4 溫度的優(yōu)化 在色譜柱為TSK－GEL?ODS－100V(3μm，4.6mm ×150mm)，流動相為甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2);進(jìn)樣量為20μL，檢測波長為276nm，流速為1.0mL/min的條件下，分別將柱溫度設(shè)定為28、26、25、24℃進(jìn)行檢測。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 準(zhǔn)確稱取EGCG對照品9.0、19.5、29.7、39.6、51.3mg，分別加純水溶解，再定容至50mL容量瓶中，備用。在流動相組成為:甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶ 2;色譜柱為:TSK－GEL? ODS－100V (3μm，4.6×150mm);流速為 1.0mL/min;柱溫為24℃條件下，精密吸取各濃度的對照品溶液20μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。

1.2.4 精密度測定 在1.2.3中所述色譜條件下，準(zhǔn)確吸取EGCG對照品溶液20μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積及保留時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相組成的優(yōu)化

在其他色譜條件相同的情況下，分別對組成為甲醇∶水∶乙酸(20∶79∶1)、甲醇∶水∶乙酸(28∶71∶1)、甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)、甲醇∶水∶乙酸(18∶80∶2)、甲醇∶水∶乙酸(20∶78∶2)的流動相進(jìn)行考察，比較了不同流動相組成對EGCG保留時間和分離度的影響。

實驗結(jié)果表明，隨著甲醇含量的提高，EGCG的保留時間逐漸縮短，其與咖啡因的分離度出現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)甲醇含量為18%時，EGCG與咖啡因未能分開(見圖1－A);當(dāng)甲醇含量為20%時，EGCG與咖啡因分離度提高，但未能達(dá)到基線分離(見圖1－B);當(dāng)甲醇含量為23%時，EGCG與咖啡因分離度進(jìn)一步提高，實現(xiàn)基線分離(見圖1－C);當(dāng)甲醇含量大于23%以后，分離度開始下降(見圖1－D)。最終得到最優(yōu)流動相組成為甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2。

2.2 色譜柱的優(yōu)化

在其他參數(shù)相同的條件下，分別采用以下色譜柱進(jìn)行實驗:Kromasil C18(5μm，4.6mm×150mm)、Kromasil C18(5μm，4.6mm×250mm)、Inertail ODS－4 C18(5μm，4.6mm×250mm)、TSK－GEL?ODS－100V (3μm，4.6mm×150mm)。分別考察了色譜柱的填料類型、填料粒徑、柱長幾方面對綠茶提取物中EGCG與咖啡因分離度的影響，如表1所示。

表1 不同色譜柱條件下咖啡因與EGCG的分離度

綠茶提取物中的成分復(fù)雜，包括EGCG、咖啡因以及EGCG的多種類似物等，要實現(xiàn)EGCG的快速高效檢測，就必須實現(xiàn)EGCG與其他物質(zhì)的快速分離，由于EGCG與咖啡因出峰時間最為接近，因此以EGCG與咖啡因的分離情況為例，顯示各色譜柱在EGCG檢測中的性能，選擇適合綠茶提取物中EGCG檢測的色譜柱。

實驗結(jié)果表明，色譜柱的長度對分離度的影響不大，但對保留時間影響較大。采用 Kromasil C185μm色譜柱進(jìn)行分離，250mm與150mm的色譜柱檢測所得分離度較為接近，效果沒有太大差異性。采用250mm的色譜柱進(jìn)行檢測，EGCG的保留時間為20min左右，檢測全程時間需要60min;而用150mm的色譜柱檢測，EGCG的保留時間為6min左右，檢測全程時間需要30min。在能夠達(dá)到要求的情況下，選擇150mm的色譜柱進(jìn)行分離測定，以實現(xiàn)EGCG的快速、高效檢測。

圖1 不同流動相組成對綠茶提取物中ECGC與咖啡因的分離的影響

色譜柱填料的修飾情況及粒徑對分離效果有一定的影響。色譜柱Kromasil C18，其填料為常規(guī)未經(jīng)修飾的C18填料;Inertail ODS－4 C18與TSK－GEL? ODS－100V色譜柱，其填料均為C18經(jīng)過一定修飾的填料。從表1中可以發(fā)現(xiàn)，填料修飾情況對EGCG與咖啡因的分離有一定影響;同時，從色譜柱填料粒徑方面可以發(fā)現(xiàn)，隨著粒徑的減小，可以進(jìn)一步提高EGCG在綠茶提取物復(fù)雜體系中的分離能力，如采用填料粒徑為3μm的TSK－GEL?ODS－100V色譜柱進(jìn)行分離，分離度可以達(dá)到2.40，表現(xiàn)出了較為顯著的優(yōu)勢。綜合考慮，選擇色譜柱為TSK－GEL?ODS－100V(3μm，4.6×150mm)。

2.3 流速的優(yōu)化

在色譜柱為TSK－GEL?ODS－100V;流動相為甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2);進(jìn)樣量為20μL;檢測波長為276nm;柱溫為室溫的條件下，分別對流速為1.0、0.9、0.8mL/min進(jìn)行實驗。

實驗結(jié)果顯示，當(dāng)流速為1.0mL/min時，EGCG與咖啡因能夠得到較好的分離，分離度為2.19，并且EGCG與其后的EGCG類似物也能實現(xiàn)有效分開，分離度為5. 44;隨著流速的降低，其對EGCG的分離情況影響不大。因此，在保證EGCG分離效果的前提下，最終選擇流速為1.0mL/min。

2.4 溫度的優(yōu)化

在色譜柱為TSK－GEL?ODS－100V;流動相為甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2);進(jìn)樣量為20μL;檢測波長為276nm;流速為1.0mL/min的條件下，分別選擇柱溫為28、26、25、24℃進(jìn)行實驗，考查不同溫度對綠茶提取物中EGCG和咖啡因分離效果的影響。實驗結(jié)果表明，EGCG與咖啡因的分離對溫度較為敏感，且隨著溫度的升高，分離度呈下降趨勢。在28、26℃時EGCG與咖啡因不能分開，為單峰;在25℃時EGCG與咖啡因分離不完全，分離度為0. 72;24℃時EGCG與咖啡因分離度為2.54，實現(xiàn)完全分離。故選擇24℃為最佳的柱溫。

2.5 線性關(guān)系

以峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，回歸方程為Y=29861582X－743171，r=0.9991，EGCG在0.2～1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

圖2ECGC的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 精密度分析

按照1.2.4方法對綠茶提取物中EGCG含量進(jìn)行測定，連續(xù)5次進(jìn)樣所得峰面積及特征峰保留時間RSD分別為1.62%和0.69%(n=5)。結(jié)果表明，該方法精密度較好，進(jìn)一步證明了方法的可行性。

3 結(jié)論

本方法在保證良好的精密度和線性關(guān)系的基礎(chǔ)上檢測綠茶提取物原料中EGCG的含量。經(jīng)過反復(fù)實驗，對色譜柱、流動相組成、流速、柱溫等高效液相色譜條件進(jìn)行了選擇和優(yōu)化。確定了色譜柱為TSK－GEL?ODS－100V，流動相組成為甲醇∶水∶乙酸= 23∶75∶2，流速為1.0mL/min，波長為276nm，柱溫為24℃為綠茶提取物原料中檢測EGCG的最佳參數(shù)。該方法分離效果好、精密度高、線性關(guān)系好，適用于保健品綠茶提取物原料中EGCG的測定，可作為產(chǎn)品原料質(zhì)量控制的方法。

［1］LEE Kwang－jin，LEE Sang－h(huán)oon.Extraction behavior of caffeine and EGCG from green and black teav［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2008(5):646－649.

［2］趙揚帆，鄭寶東.植物多酚類物質(zhì)及其功能學(xué)研究進(jìn)展［J］.福建輕紡，2006(11):107－110.

［3］于華忠，張東山，龔竹瓊.茶葉中EGCG含量分析研究［J］.生理生化，2004(4):28.

［4］徐志泉，易著文，何小解.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大鼠腎衰的治療研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2006，22(16): 2471－2472.

［5］趙麗萍，邵宛芳.茶葉中EGCG功效研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23(7):143－147.

［6］楊性民，劉青梅，高海月，等.茶多酚中EGCG分離純化工藝優(yōu)化［J］.中國食品學(xué)報，2006，6(5):77－80.

［7］王霞，高麗娟，林炳昌.表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的分離與制備［J］.食品科學(xué)，2005，26(9):242－246.

［8］謝瑤，石萌萌，龐欣.高效液相色譜及液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在保健食品檢測中的應(yīng)用［J］.化學(xué)通報，2010(8):684－688.

［9］鄒耀洪.高效液相色譜/質(zhì)譜分析茶樹老葉中兒茶素［J］.分析化學(xué)，2003，31(3):381.

［10］徐仲溪，劉仲華，王坤波，等.綠茶多酚和兒茶素提取與原料品質(zhì)關(guān)系的研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，30(3): 257－260.

［11］凌敏，劉麗，袁華，等.茶多酚化學(xué)及其在醫(yī)藥保健中的應(yīng)用［J］.湖北化工，2001(3):29－31.

［12］李萌，王華燕，胡文祥，等.HPLC法快速測定茶多酚中兒茶素類及咖啡因含量［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2007，9(6):506－507.

［13］張星海，郭碧花，沈生榮.兒茶素富集和EGCG單體純化新工藝研究［J］.茶葉，2002，28(3):136－137.

［14］劉官樹，姚思德，倪謹(jǐn)，等.EGCG輻射保護(hù)作用的研究［J］.輻射研究與輻射工藝學(xué)報，2002，20(2):87－92.

［15］姜紹通，李慧星，馬道榮，等.AB－8樹脂吸附分離EGCG和ECG的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(5):972－973，980.

［16］王瑞芳，陳發(fā)河，吳光斌，等.吸附樹脂法分離兒茶素EGCG和咖啡因的研究［J］.食品科學(xué)，2009(7):40－42.

Determination of epigallocatechin gallate in green tea extract by high performance liquid chromatography

SHI Meng－meng，WANG Jia，XIE Yao*
(Beijing Dawn Aerospace Bio－Tech CO.，LTD.，Beijing 100190，China)

A method for determination of EGCG by HPLC in green tea extract was developed.The chromatographic conditions including mobile phase composition，chromatographic column，flow rate and temperature were optimized.Exactly，TSK－GEL?ODS－100V column was used with the mobile phase of methanol:water:aceticacid (23∶75∶2)at column temperature of 24℃，and the flow rate was 1.0mL/min with UV detection at 276nm.The results showed that EGCG was rapidlly separated and detected in the complex system contained caffeine and EGCG similarities.With the advantages of simple，low cost，high efficency and good reproducibility，this method could be successfully used for quality control in the determination of EGCG in green tea extract.

green tea extract;EGCG;HPLC;determination;quality control

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0476－04

2011－08－31 *通訊聯(lián)系人

石萌萌(1981－)，女，本科，工程師，從事保健品分析檢測方向的研究。