李繼文，郭曉燕，王 騰，李翠清，*

(1.北京化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，北京 100029; 2.北京石油化工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，北京 102617)

熒光衍生化法測定不同季節(jié)桑葉中1-脫氧野尻霉素的含量

李繼文1，2，郭曉燕2，王 騰2，李翠清2，*

(1.北京化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，北京 100029; 2.北京石油化工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，北京 102617)

目的:建立測定桑葉中1－脫氧野尻霉素(1－DNJ)含量的方法，并比較不同季節(jié)桑葉中1－DNJ的含量。方法:采用高效液相色譜法測定，以芴甲氧羰酰氯(FMOC－Cl)為柱前衍生化試劑，對衍生化條件進(jìn)行了優(yōu)化;色譜柱為Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相為乙腈－0.1%醋酸(50∶50)，流速1.0mL/min，柱溫30℃，熒光檢測器激發(fā)波長254nm，發(fā)射波長322nm。結(jié)果:1－DNJ在10～35mg/L范圍內(nèi)線性良好(r=0.99959)，檢測限為0.80mg/L(S/N =3)，平均回收率為95.38%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.28%(n=5)。桑葉中1－DNJ的含量在不同生長季節(jié)間存在顯著差異。結(jié)論:方法簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于桑葉中1－DNJ含量的定量分析。

桑葉，1－脫氧野尻霉素，高效液相色譜法，熒光衍生化

桑葉，是?？浦参锷?Morus albaL.)的葉子，異名“鐵扇子”，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒、味甘苦，歸肺、肝經(jīng)，具有祛風(fēng)清熱、涼血明目等功效［1］。1993年我國衛(wèi)生部公布桑葉為藥食兩用品，而在《中華人民共和國藥典》2010版中也收錄桑葉主治風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭痛，目赤昏花［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究表明，桑葉中含有的獨(dú)特的生物堿1－脫氧野尻霉素(1－DNJ，結(jié)構(gòu)見圖1)，是其主要的活性成分之一，具有顯著的藥理作用。有研究認(rèn)為，1－DNJ為α－糖苷酶抑制劑，能有效地降低餐后的血糖濃度，達(dá)到預(yù)防和治療糖尿病的效果［3－8］。我國是世界上最大的桑樹種植國，桑樹資源豐富，種類繁多，分布廣泛，而1－DNJ在桑葉中的含量也隨產(chǎn)地及品種的不同有所差異。有關(guān)不同產(chǎn)地不同品種桑葉中1－脫氧野尻霉素含量的分析已有報道［9－10］，而有關(guān)不同季節(jié)桑葉中1－DNJ含量的比較研究報道較少。本文參照國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)方法［11－12］，并加以優(yōu)化，采用柱前衍生化高效液相色譜法建立了桑葉中1－DNJ含量的測定方法，并對北京市大興區(qū)安定鎮(zhèn)御林古桑園所產(chǎn)的不同生長季節(jié)桑葉中的1－DNJ的含量進(jìn)行了測定，為今后該地區(qū)桑葉的綜合開發(fā)利用提供了指導(dǎo)。

圖1 1－脫氧野尻霉素的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 采自北京市大興區(qū)安定鎮(zhèn)御林古桑園(經(jīng)中國食品藥品檢定研究院張繼副研究員鑒定為?？浦参锷?Morus albaL.)的葉);1－脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%) 上海同田生物技術(shù)有限公司;芴甲氧羰酰氯(FMOC－Cl) 美國ALDRICH公司;色譜乙腈、甘氨酸、四硼酸鉀 國藥集團(tuán);冰醋酸 北京化工廠;實驗用水 為娃哈哈純凈水;其他試劑 均為分析純。

Waters2695高效液相色譜系統(tǒng) 配有Waters2475熒光檢測器和Empower操作系統(tǒng)，美國Waters公司;SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;SB－4200 DTN超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;超級恒溫水槽 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葉樣品的制備 準(zhǔn)確稱取不同季節(jié)的干燥桑葉粉末1.0g，加入0.05mol/L的鹽酸溶液25mL，80℃下回流 30min，抽濾，取濾液，濾渣再加入0.05mol/L的鹽酸溶液25mL重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，濃縮，置于10mL容量瓶中，加蒸餾水定容，備用。

衍生化過程:取上述提取液20μL置于1.5mL的離心管中，加入0.4mol/L的硼酸鹽緩沖液(pH=8.5) 20μL及2mmol/L的FMOC－Cl的乙腈溶液40μL，振蕩混勻，于25℃水浴中反應(yīng)20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，靜置5min，讓多余的衍生化試劑反應(yīng)完。最后加入 1.5mL 0.1%(V/V)的醋酸水溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過后取10μL進(jìn)行色譜分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液 精密稱取一定量的1－DNJ標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用純凈水定容，得到濃度為1.0g/L的1－DNJ標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于4℃避光保存。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用純凈水稀釋至濃度為10、15、20、25、30、35mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，分別按上述方法衍生化后取10μL進(jìn)行色譜分析。

1.2.3 空白溶液的制備 準(zhǔn)確量取純凈水20μL置于1.5mL的離心管中，加入0.4mol/L的硼酸鹽緩沖液(pH=8.5)20μL，及2mmol/L的FMOC－Cl乙腈溶液40μL，振蕩混勻，于25℃水浴中反應(yīng)20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，靜置5min，讓多余的衍生化試劑反應(yīng)完。最后加入1.5mL 0.1%(V/V)的醋酸水溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過后取10μL進(jìn)行色譜分析。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)及SunFire C18預(yù)柱(4.6mm× 20mm，5μm);流動相:乙腈－0.1%冰醋酸(50∶50，V/V);流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;熒光檢測器激發(fā)波長254nm，發(fā)射波長322nm;進(jìn)樣體積:10μL。

2 結(jié)果與討論

1－DNJ為典型的哌啶型生物堿，結(jié)構(gòu)中沒有苯環(huán)、雙鍵及羰基等發(fā)色團(tuán)，不適用于紫外檢測，且結(jié)構(gòu)中含有多個羥基，屬氮雜糖類，分子極性較大，普通C18色譜柱難以保留，定性定量分析均較困難。FMOC－Cl是一種常見的衍生化試劑，可用于仲胺和伯胺的衍生化，結(jié)構(gòu)中具有熒光發(fā)光基團(tuán)，衍生化產(chǎn)物具有穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度。本實驗以FMOC－Cl作為衍生化試劑，將FMOC－Cl在溫和的條件下與1－DNJ中的仲胺基團(tuán)反應(yīng)生成穩(wěn)定的熒光衍生物，采用熒光檢測器進(jìn)行檢測。解決了1－DNJ無紫外吸收難以檢測的困難，同時克服了1－DNJ極性過大，普通C18色譜柱無法保留的缺點。衍生化反應(yīng)方程式如圖2所示。

圖2 1－DNJ的衍生化反應(yīng)方程式

2.1 系統(tǒng)適用性實驗

2.1.1 檢測波長的選擇 參照文獻(xiàn)［10－11］的方法，選用激發(fā)波長254nm，發(fā)射波長322nm進(jìn)行檢測。

2.1.2 流動相比例的選擇 流動相(乙腈－0.1%醋酸)中，0.1%醋酸比例大于60%時，1－DNJ的保留時間在10min左右，但色譜峰未能達(dá)到良好的分離，且水相比例過高后，色譜柱柱壓過高，影響色譜柱的使用壽命。采用體積比65∶35的乙腈－0.1%醋酸作為流動相時，保留時間過長。而選擇體積比50∶50的乙腈－0.1%醋酸則能達(dá)到較好的分離效果且峰形良好，因此流動相組成為乙腈－0.1%醋酸(50∶50)。

分別取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液各10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果如圖3所示。其中標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液中色譜峰1的峰面積隨1－DNJ濃度的變化而呈線性的變化，而空白溶液中無色譜峰1出現(xiàn)，且在同時不加1－DNJ和Gly的空白溶液中只有色譜峰3出現(xiàn)。因此推斷，色譜峰1為1－DNJ－FMOC，色譜峰2為Gly－FMOC，色譜峰3為FMOC－OH。從圖3中可以看出，樣品中的1－DNJ與相鄰組分均得到了較好的分離，Gly－FMOC及衍生化試劑的水解產(chǎn)物FMOC－OH均不干擾組分的測定。

2.2 衍生化反應(yīng)條件的選擇

2.2.1 衍生化反應(yīng)試劑濃度的考察 以標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液為對象考察了衍生化試劑FMOC－Cl的濃度對衍生化反應(yīng)的影響，在 FMOC－Cl的濃度為0～2mmol/L的范圍內(nèi)，衍生化產(chǎn)物隨衍生化試劑濃度的增大而增加，在衍生化試劑濃度為2mmol/L時，衍生化產(chǎn)物峰面積達(dá)到最大。當(dāng)衍生化試劑濃度超過3mmol/L時，Gly－FMOC及FMOC－OH的響應(yīng)信號均超過了檢測器檢出限，因此最終選擇2mmol/L作為衍生化試劑的最佳濃度。

圖3 樣品高效液相色譜圖

2.2.2 衍生化反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度的考察 固定其他條件，將同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液衍生化反應(yīng)不同時間，衍生化時間分別為5、10、15、20、25min，結(jié)果表明:在衍生化反應(yīng)20min后，衍生化產(chǎn)物的峰面積趨于穩(wěn)定，因此本實驗選擇的衍生化反應(yīng)時間為20min。固定其他條件，將同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在不同溫度下衍生化反應(yīng)20min，溫度分別為20、25、30、35℃，結(jié)果表明:在25℃下，衍生化產(chǎn)物達(dá)到最大峰面積的時間最短，當(dāng)衍生化反應(yīng)溫度超過30℃時，衍生化產(chǎn)物的最大峰面積反而降低。因此，本實驗選擇的衍生化溫度為25℃。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

分別取標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，按上述方法衍生化，取10μL按“1.2.4”色譜條件測定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X對色譜峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y= 1742310X+530220.71，r=0.99959。結(jié)果表明，1－DNJ在質(zhì)量濃度為10～35mg/L的范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，測得信噪比(S/N)為3時，1－DNJ的最低檢測限為0.80mg/L。

2.4 精密度實驗

精密吸取同一批樣品衍生化溶液，按“1.2.4”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積的RSD為0.58% (n=6)，結(jié)果表明，本實驗方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性實驗

取同一批桑葉樣品，按“1.2.1”的方法平行制備6份，按“1.2.4”色譜條件分別進(jìn)樣，測得峰面積的RSD為0.54%(n=6)。結(jié)果表明，本實驗方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一批桑葉樣品，按“1.2.1”的方法制備，置于冰箱中4℃避光保存，分別間隔12h按“1.2.4”色譜條件重復(fù)測定6次。結(jié)果表明，樣品衍生化后在72h保持穩(wěn)定，RSD為0.46%(n=6)。

2.7 加樣回收率實驗

準(zhǔn)確稱取已知1－DNJ含量的桑葉樣品適量，平行稱取5份，分別精密加入一定量的1－DNJ標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.1”的方法制備，并按“1.2.4”色譜條件測定1－DNJ含量，結(jié)果見表1。平均回收率為95.38%，RSD為2.28%。

表1 1－DNJ加樣回收率的測定(n=5)

2.8 不同季節(jié)桑葉中1－DNJ含量的測定

準(zhǔn)確稱取不同季節(jié)采集的桑葉樣品，按“1.2.1”的方法制備，并按“1.2.4”色譜條件測定1－DNJ含量。結(jié)果見圖4。

圖4 不同季節(jié)桑葉中1－DNJ的含量變化

3 結(jié)論

本實驗對產(chǎn)自北京市大興區(qū)安定鎮(zhèn)御林古桑園的不同季節(jié)的桑葉中1－DNJ的含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明在相同的提取和檢測條件下，7、8、9月份桑葉中1－DNJ的含量明顯高于10月和11月，其中8月份含量最高，說明桑葉中1－DNJ的含量可能與氣侯溫度等因素有關(guān)，夏季(7、8、9月份)溫度較高，雨水光線充足，桑葉較成熟，桑葉中1－DNJ的含量較高，秋季(10、11月份)溫度較低，桑葉中1－DNJ的含量也隨之減少。結(jié)果初步揭示了北京地區(qū)所產(chǎn)桑葉中1－DNJ的含量隨季節(jié)變化的趨勢，對推動該地區(qū)桑資源的開發(fā)利用，具有一定的指導(dǎo)意義。

高效液相色譜－熒光檢測法檢測桑葉中1－脫氧野尻霉素(1－DNJ)的含量，具有準(zhǔn)確性高、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點，可用于桑葉中1－脫氧野尻霉素(1－DNJ)含量的測定。

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Determination of 1－deoxynojirimycin in Morus alba L.leaves of different seasons by fluorometric derivatization

LI Ji－wen1，2，GUO Xiao－yan2，WANG Teng2，LI Cui－Qing2，*
(1.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China; 2.Beijing Institute of Petrochemical Technology，Beijing 102617，China)

Objective:To develop a high performance liquid chromatographic method for the determination of 1－deoxynojirimycin(DNJ)in Morus alba L.leaves and contrast the content of 1－DNJ in different seasons.Methods: The separation was performed with a Kromasil C18column(4.6mm×250mm，5μm)at 30℃ and the mobile phase consisted of acetonitrile－0.1%aqueous acetic acid(50∶50)，at the rate of 1.0mL/min.The 1－DNJ marked with 9－fluorenylmethyl chloroformate(FMOC－Cl)was detected at excitation wavelength of 254nm and emission wavelength of 322nm.Results:The calibration curve was linear over the concentration range from 10mg/L to 35mg/L (r=0.99959)，the limit of detection was 0.80mg/L(S/N=3)and the average recovery was 95.38%(RSD=2.28%). The results showed that the content of 1－DNJ was significantly different in different seasons.Conclusion:This method was simple，rapid，and accurate and was suitable for the determination of 1－DNJ in Morus alba L.leaves.

Morus alba L.leaves;1－ deoxynojirimycin;high performance liquid chromatography; fluorometric derivatization

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0462－04

2011－08－29 *通訊聯(lián)系人

李繼文(1983－)，男，碩士研究生，研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)。

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點項目(211003);北京市教育委員會科技發(fā)展計劃面上項目(KM201110017002)。