劉變芳，石 磊，喬冬玲，雒 丹

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100)

抑菌型納豆菌株的分離篩選及其微生態(tài)菌劑的制備

劉變芳，石 磊，喬冬玲，雒 丹

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100)

納豆桿菌具有抗菌、溶血栓、產(chǎn)生各種胞外酶等優(yōu)良特征，著重關(guān)注了其抗菌活性，期望能夠?yàn)轱暳咸砑涌咕臀⑸鷳B(tài)制劑的研究提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)從市售不同品種豆豉和納豆中，分離純化納豆菌株23株，并通過(guò)對(duì)納豆菌個(gè)體特征顯微觀察、水解酪蛋白實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。研究了不同納豆菌株對(duì)4種致病菌，志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的抗性特征，選育出7株抗致病菌性能良好的納豆菌。選育的菌株進(jìn)行組合發(fā)酵，采用冷凍干燥技術(shù)制備復(fù)合納豆菌微生態(tài)制劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，選育的納豆菌株抑菌效果明顯，冷凍干燥的微生態(tài)制劑中活菌數(shù)為1.05×109cfu/g，益生菌的存活率為72.7%。

納豆菌株，分離選育，抗致病菌，微生態(tài)制劑

納豆中含有多種營(yíng)養(yǎng)因子，使其具有多種功能，如溶血栓、抗腫瘤、降血壓、抗氧化性、防止骨質(zhì)疏松、促凝血等［1］。納豆芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有鞭毛，可形成芽孢，是枯草芽孢桿菌屬。納豆芽孢桿菌能增強(qiáng)以厭氧菌為優(yōu)勢(shì)菌群的腸道正常菌群的生長(zhǎng)能力，消耗腸道中的氧，從而抑制有害需氧菌的生長(zhǎng);還能產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、氨基酸、促生長(zhǎng)因子等，參與機(jī)體的生長(zhǎng)代謝。納豆菌分泌的各種胞外酶，包括蛋白酶、淀粉酶、谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶、脂肪酶和植酸酶等，比其他枯草芽孢桿菌分泌同樣活性的酶高幾十倍，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。納豆菌不僅能發(fā)酵大豆，生產(chǎn)出營(yíng)養(yǎng)豐富、功能多樣的納豆產(chǎn)品，還能用于生產(chǎn)保健藥品、調(diào)味品以及微生態(tài)制劑，是美國(guó)FDA公布的40種益生菌之一［2］。微生態(tài)制劑是用益生菌(Probiotics)經(jīng)培養(yǎng)而制成的活菌制劑，產(chǎn)品無(wú)污染、無(wú)毒副作用，在使用時(shí)多制成該菌休眠狀態(tài)的活菌制劑［3］。納豆菌能在條件不利的情況下形成芽孢，將自己保護(hù)起來(lái)，復(fù)活率高。由于納豆菌具有芽孢，因而能耐鹽耐堿、耐高溫及耐擠壓，在制粒過(guò)程及通過(guò)酸性胃環(huán)境中均能保持高度的穩(wěn)定性，因此是生產(chǎn)微生態(tài)制劑的理想菌株［4］。納豆菌可以產(chǎn)生的抗菌素如桿菌肽、多黏菌素、2，6－吡啶二羧酸，具有抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、傷寒菌、痢疾菌及O－157∶H7大腸桿菌等致病菌的作用，可以起到抗菌素的作用［5］。本研究關(guān)注納豆菌的抗菌功能，分離篩選了抑菌型納豆菌株，并將其制備為微生態(tài)制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆 旭松食品株式會(huì)社，購(gòu)自西安;豆豉1，豆豉2，豆豉3 分別購(gòu)自楊凌本地菜市場(chǎng)、好又多超市、人人家超市;枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(ATCC25922) 均由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;基本培養(yǎng)基 蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%;酪蛋白培養(yǎng)基 脫脂乳粉5%、NaCl 0.5%、葡萄糖1%;大豆氮源基本培養(yǎng)基 大豆蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%;發(fā)酵液［1］蔗糖2.5%、大豆蛋白胨0.72%、豆粕6.3%、Na2HPO40.45%、NaH2PO40.4%、MgSO40.05%、CaCl20.01%、pH7.0。

SPX－150智慧生化培養(yǎng)箱 上海悅豐儀器儀表有限公司;CH2－82A恒溫振蕩器 國(guó)華企業(yè);Eclipse E100雙目生物顯微鏡 Nikon;MCFD5508 TY8276冷凍凍干機(jī) 美國(guó)SIM;S－450D超聲波細(xì)胞破碎儀

美國(guó)BRANSON;超凈無(wú)菌工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納豆菌株分離純化 分別取納豆以及豆豉1、豆豉2、豆豉3樣品10g，加入已滅菌的100mL生理鹽水中，浸泡、振搖30min后，使得豆子的表面物質(zhì)在水中分散均勻，用移液槍分別將每種懸浮液取100μL，涂布接種在基本培養(yǎng)基上，倒置36℃培養(yǎng)16h。觀察并轉(zhuǎn)接單菌落。

1.2.2 納豆菌的鑒定

1.2.2.1 個(gè)體形態(tài)鏡檢與革蘭氏染色 依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［6］中枯草芽孢桿菌的菌落特征:菌落為圓形，菌落直徑約2mm，邊緣不規(guī)則，呈現(xiàn)葉狀，乳白色，色暗無(wú)光澤，不透明，有拉絲。鏡檢觀察納豆菌個(gè)體形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色。挑取革蘭氏染色陽(yáng)性，短桿狀，具芽孢，芽孢中生，呈橢圓或柱狀，不明顯膨大的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 生理生化鑒定 依據(jù)伯杰手冊(cè)(第八版)和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》上芽孢桿菌的鑒定方法對(duì)經(jīng)過(guò)酪蛋白平板實(shí)驗(yàn)篩選的菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行耐鹽能力實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、水解淀粉實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、水解明膠實(shí)驗(yàn)、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)［6］。

酪蛋白水解實(shí)驗(yàn):挑取菌株在酪蛋白培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)16～18h，之后觀察，挑選出有明顯透明亮帶的菌株保存。

耐鹽能力實(shí)驗(yàn):用NaCl作鹽濃度梯度測(cè)試納豆菌株的生長(zhǎng)狀況。

過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn):將菌株涂布接種在平板上，30℃上培養(yǎng)24h，在菌落上面滴3%H2O2，觀察是否有氣泡產(chǎn)生，有氣泡產(chǎn)生的為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。

VP實(shí)驗(yàn):將菌株接種在液體培養(yǎng)液中，37℃，24h后加等量的40%的NaOH，再加少許肌酸，猛烈振蕩，放置在37℃下保持10～30min觀察，產(chǎn)生紅色的菌株為VP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

水解淀粉實(shí)驗(yàn):將菌株在淀粉培養(yǎng)基平板上點(diǎn)接種，30℃培養(yǎng)2～3d，形成明顯菌落后，在菌落上滴加碘液，平板背景呈藍(lán)黑色，菌落四周均不變色，有明顯透明圈，證明該菌分泌淀粉酶。

水解明膠實(shí)驗(yàn):在明膠試管中穿刺接種，培養(yǎng)2～3d，在20℃下觀察菌的生長(zhǎng)狀況及明膠液化情況。

發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn):將斜面上挑取培養(yǎng)物作穿刺接種兩支HL培養(yǎng)基，其中一支于接種后滴加溶化的1%瓊脂液于表面，高度約1cm，于36℃培養(yǎng)48h。兩支培養(yǎng)基均無(wú)變化為產(chǎn)堿型或不分解糖型;兩支培養(yǎng)基均產(chǎn)酸(黃色)為發(fā)酵型;若僅不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸為氧化型。

吲哚實(shí)驗(yàn):將菌接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)液中加入乙醚1～2mL，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入5～10滴吲哚試劑，如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，為吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，反之為陰性反應(yīng)。

1.2.3 納豆菌株的抑菌測(cè)定

1.2.3.1 單菌株納豆菌抑菌實(shí)驗(yàn) 將納豆菌接種于液態(tài)的基本培養(yǎng)基，志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌接種于液態(tài)的LB培養(yǎng)基，36℃，120r/min搖床培養(yǎng)16～18h，作為備用菌懸液。將1mL納豆菌懸液置于1.5mL的離心管中，4000r/min離心10min，取上清液備用。

牛津杯雙層平板抑菌實(shí)驗(yàn)，先在培養(yǎng)皿上倒少量LB培養(yǎng)基，待凝固后，放置牛津杯并倒上第二層含指示菌的培養(yǎng)基，凝固后取出牛津杯，在小孔內(nèi)加入100μL納豆菌上清液，36℃培養(yǎng)16～18h，觀察抑菌圈大小。每株納豆菌重復(fù)3孔。

1.2.3.2 優(yōu)化組合的抑菌實(shí)驗(yàn) 依據(jù)單菌株抑菌效果，篩選7株抑菌效果明顯的納豆菌株，進(jìn)行優(yōu)化組合發(fā)酵。檢測(cè)優(yōu)化組合對(duì)致病菌的抑制效果。雙層平板抑菌實(shí)驗(yàn)方法同1.2.3.1。將實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌和購(gòu)買的旭松食品株式會(huì)社納豆作為對(duì)照進(jìn)行同樣發(fā)酵處理。

1.2.4 發(fā)酵氮源對(duì)納豆菌抑菌效果的影響 采用大豆氮源培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基分別培養(yǎng)篩選的抗菌納豆菌株，雙層平板法檢測(cè)不同氮源對(duì)抑菌效果的影響［7－8］。

1.2.5 超聲波協(xié)同離心法處理納豆菌發(fā)酵液對(duì)抑菌效果的影響 將篩選的抗菌納豆菌株發(fā)酵液分別用離心和超聲波處理，檢測(cè)其對(duì)致病菌抑制效果的影響。菌懸液的制備和雙層平板抑菌實(shí)驗(yàn)同上。

納豆菌懸液3mL置于離心管中，用超聲波細(xì)胞破碎儀處理，超聲頻率為24kHz，功率為200W，超聲處理時(shí)間5min，在冰浴中進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，然后用4000r/min，離心10min，吸取上清液備用［9］。

1.2.6 混合微生態(tài)菌劑的制作 篩選的7株抗菌效果明顯的菌株分別為H1、H5、H8、H9、C5、C8、R6，作為復(fù)合微生態(tài)菌劑的菌株。將復(fù)合納豆菌接種發(fā)酵培養(yǎng)液中36℃，120r/min搖床發(fā)酵48h。發(fā)酵液中加入20%(W/V)脫脂奶粉，在－20℃條件下預(yù)凍12h后，移至真空冷凍干燥機(jī)，－72℃下進(jìn)行凍干燥制備成固體菌劑［9－11］。采用稀釋平板法分別測(cè)定發(fā)酵液和固體菌劑的活菌數(shù)。

表1 納豆菌生理生化特征鑒定

存活率(%)=N后/N前×100%

注:N后為干燥前總菌數(shù)(發(fā)酵液體積(mL)× cfu/mL發(fā)酵液)，N前為干燥后總菌數(shù)(菌粉(g)× cfu/g菌粉)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆菌菌株的水解酪蛋白實(shí)驗(yàn)

由圖1可見(jiàn)，納豆菌可以水解酪蛋白，同時(shí)分解酪蛋白的酶類屬于胞外酶。對(duì)水解透明圈明顯的菌株做標(biāo)記［12］，初步篩選到23株納豆菌分別為R1、R3、R6、N1～N4、H1～H5、H7～H9、C2～C9。

圖1 納豆菌的水解酪蛋白平板

2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，篩選出的23株菌在耐受7%氯化鈉、VP反應(yīng)、過(guò)氧化氫酶作用等生化鑒定中與枯草芽孢桿菌相同，吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性反應(yīng)，其余均呈陽(yáng)性反應(yīng)。

2.3 單株納豆菌的抑菌結(jié)果

由圖2可見(jiàn)，不同納豆菌株對(duì)致病菌株的抑制效果存在明顯區(qū)別。對(duì)大腸桿菌抑制效果強(qiáng)的納豆菌株有H5、H1、H 9;對(duì)沙門氏菌的抑制效果強(qiáng)的納豆菌株有H5、H1、H 8;對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果強(qiáng)的納豆菌有H1、R6、H 5;對(duì)志賀氏菌的抑制效果強(qiáng)的納豆菌株有H5、C5、C8。

2.4 復(fù)合納豆菌劑的抑菌結(jié)果

由圖3可知，復(fù)合納豆菌劑對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯優(yōu)于原料納豆和單株芽孢桿菌。復(fù)合納豆菌劑和原料納豆發(fā)酵液

圖2 單株納豆菌抑菌結(jié)果

圖3 復(fù)合納豆菌劑抑菌結(jié)果

2.5 大豆氮源和超聲波協(xié)同離心處理發(fā)酵液對(duì)抑菌效果的影響

由圖4可知，超聲波協(xié)同離心方法處理納豆菌發(fā)酵液可以顯著提高其抑菌效果。用大豆氮源代替基本培養(yǎng)基中的蛋白胨氮源可以使發(fā)酵液抑菌效果增強(qiáng)，但差別不顯著。

圖4 大豆氮源和超聲波協(xié)同離心處理發(fā)酵液對(duì)抑菌效果的影響

2.6 納豆菌微生態(tài)制劑

100mL發(fā)酵液冷凍干燥后獲得的制劑粉末為11.7g。通過(guò)稀釋平板計(jì)數(shù)法得發(fā)酵液活菌數(shù)為8.93 ×107cfu/mL，干燥后復(fù)合菌劑活菌數(shù)為 1.05× 109cfu/g。冷凍干燥后微生態(tài)制劑的益生菌存活率為72.7%。

3 小結(jié)

實(shí)驗(yàn)從32株原始納豆菌株中篩選出23株對(duì)沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有明顯抑制作用的納豆菌株。實(shí)驗(yàn)針對(duì)4種致病菌確定了復(fù)合納豆菌劑組合為H1、H5、H8、H9、R6、C5、C8。采用真空冷凍干燥技術(shù)制備了納豆菌的微生態(tài)制劑，復(fù)合納豆菌劑中活菌數(shù)達(dá)1.05×109cfu/g。冷凍干燥過(guò)程中采用20%的脫脂乳作為保護(hù)劑，納豆菌存活率為 72.7%，與王發(fā)祥等［13］報(bào)導(dǎo)的存活率86.8%相比偏低，因此本研究有待于對(duì)真空冷凍干燥工藝的參數(shù)和保護(hù)劑配方做進(jìn)一步深入探討。

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Screening of the Natto strains and preparation of the Natto microecological agent

LIU Bian－fang，SHI Lei，QIAO Dong－ling，LUO Dan
(College of Food Science and Engineering，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100，China)

The bacillus natto as the beneficial and safety strains to human body，are aerobic gram－positive bacterium.It belongs to Bacillus subtilis.The original materials were different brand glycine maxes and natto which brought from market.23 bacillus natto strains were separated and purified from the material，according to the particular of bacterial colony.At the same time，these strains were identified as bacillus subtilis by its main physiological and biochemical properties，for example，casein hydrolysate experiment，VP experiment and so on.By the experiment on resistance characteristic to the different strains，including Shigellae，Staphylococcus aureus，Salmonella，Escherichia coli，selected out 7 strains anti－pathogenic bacillus natto with good performance.Put different strains with the excellent properties together for the mixed fermentation and tested different bacillus natto strains combinations on antibacterial properties.Finally，made the best bacillus natto strains combination into the natto microecological agent by vacuum freeze drying method.The experiment results showed that the natto strain elected had obvious antibacterial effect.The viable count of the microecological agent was 1.05×109cfu/g and the bacillus natto survival rate was 72.7%.

bacillus natto;screening breeding;resistance pathogenic bacteria;microecological agent

TS201.3

A

1002－0306(2011)12－0210－04

2011－07－14

劉變芳(1975－)，女，博士，講師，主要從事食品微生物學(xué)及分子生物學(xué)研究。

西北農(nóng)林科技大學(xué)青年啟動(dòng)基金(08080230)。