胡 弋, 李 濤, 徐 競, 唐小唪, 劉良明△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院1麻醉科，2野戰(zhàn)外科研究所二室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶 400042)

缺血預(yù)處理對失血性休克大鼠血管反應(yīng)性及鈣敏感性的影響*

胡 弋1,2, 李 濤2, 徐 競2, 唐小唪1, 劉良明2△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院1麻醉科，2野戰(zhàn)外科研究所二室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶 400042)

目的觀察缺血預(yù)處理對失血性休克血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響。方法通過觀察不同缺血預(yù)處理方法對失血性休克大鼠存活時間和24 h存活率的影響，選擇最適缺血預(yù)處理方法。在體實驗，觀察缺血預(yù)處理對失血性休克大鼠腸系膜上動脈(SMA)血管管徑對去甲腎上腺素 (NE)收縮反應(yīng)性和NE升壓反應(yīng)的影響；離體實驗，應(yīng)用離體血管環(huán)張力測定技術(shù)，觀察缺血預(yù)處理對失血性休克后大鼠SMA環(huán)血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響。結(jié)果確定最適缺血預(yù)處理方法為：夾閉腹主動脈1 min，開放5 min，重復(fù)3次，2 h后復(fù)制失血性休克模型，這種方法可顯著增加失血性休克大鼠的存活時間和24 h存活率。在體實驗，缺血預(yù)處理可顯著增加休克晚期NE的升壓效應(yīng)和在體SMA對NE的收縮反應(yīng)(P<0.01)。離體實驗，與失血性休克對照組比較，缺血預(yù)處理組SMA在休克早期(休克即刻)對NE的收縮反應(yīng)性和鈣敏感性明顯下降(P<0.05)，但與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)；在休克后期(休克2 h、3 h、4 h)，缺血預(yù)處理組SMA對NE的收縮反應(yīng)性和鈣敏感性顯著增加(P<0.05)，且與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論缺血預(yù)處理可能通過改善血管鈣敏感性發(fā)揮對休克后期血管反應(yīng)性的保護效應(yīng)。

缺血預(yù)處理； 休克，出血性； 血管反應(yīng)性； 鈣敏感性

材 料 和 方 法

1動物

清潔級SD大鼠112只，雌雄不拘，體重(218.0±25.6) g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。

2不同IPC方法對失血性休克大鼠存活率和24h存活時間的影響

40只大鼠隨機分為失血性休克對照組、IPCⅠ、Ⅱ、Ⅲ組，每組大鼠均為10只。實驗前12 h大鼠禁食、自由飲水，實驗當(dāng)天戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后, 經(jīng)右側(cè)股動、靜脈插管,股動脈接水銀血壓計供放血和監(jiān)測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，股靜脈供復(fù)蘇。IPCⅠ、Ⅱ、Ⅲ組打開腹腔，分離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)分支處的腹主動脈，分別夾閉腹主動脈1 min，開放5 min；夾閉3 min，開放3 min；夾閉3 min，開放5 min，均重復(fù)3次；失血性休克對照組則僅分離SMA分支處的腹主動脈。4組大鼠均在上述處理2 h后經(jīng)右側(cè)股動脈導(dǎo)管放血，在10 min內(nèi)將MAP降至40 mmHg，在此水平維持4 h后，將抽取的全血及等量乳酸林格氏液在30 min內(nèi)回輸入大鼠體內(nèi)，記錄大鼠24 h存活時間及存活率。

3IPC對失血性休克大鼠去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)升壓效應(yīng)及在體SMA對NE收縮反應(yīng)性的影響

24只大鼠隨機分為假手術(shù)組、失血性休克對照組和IPC組(根據(jù)上述實驗選擇最適IPC方法)，每組大鼠均為8只。其中失血性休克對照組和IPC組于復(fù)制失血性休克模型前、剝離大鼠SMA主干，分別在休克前，休克后10 min、30 min、1 h、2 h、3 h和4 h經(jīng)股靜脈給予NE(3 μg/kg),記錄大鼠使用NE前后股動脈壓值，其差值即為NE作用后MAP變化，反映整體血管反應(yīng)性；同時采用倒置顯微鏡(CK40，Olympus)觀察并記錄使用NE 前后大鼠SMA主干管徑的變化,以使用NE前后大鼠SMA管徑差值占使用NE前大鼠SMA管徑的百分率(%)來評價大鼠SMA對NE的收縮反應(yīng)性。假手術(shù)組除不放血外，其它處理同失血性休克對照組。

4IPC對失血性休克大鼠離體SMA血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響

完善科研項目經(jīng)費預(yù)算管理，首先要提高項目負責(zé)人和財務(wù)部門對項目預(yù)算的認識，再依據(jù)實際情況編制更加科學(xué)合理的科研項目經(jīng)費預(yù)算和按照規(guī)定流程調(diào)整預(yù)算。

104只大鼠隨機分為假手術(shù)組、失血性休克對照組和IPC組，其中失血性休克對照組和IPC組又根據(jù)休克時相點分為休克10 min、30 min、1 h、2 h、3 h和4 h 6個亞組，每組大鼠均為8只。處死大鼠取SMA，清除周圍結(jié)締組織，制作成2-3 mm長的血管環(huán)2根,其中1根用于血管反應(yīng)性測定,另1根用于鈣敏感性測定。

將所取SMA血管環(huán)掛于注有Krebs-Henseleit液[K-H液(mmol/L)：NaCl 118， KCl 4.7，NaHCO325，KH2PO41.03 ，MgSO4·7H2O 0.45，CaCl22.5，葡萄糖11.1，pH 7.4]離體器官灌流槽的浴槽中，持續(xù)充入95%O2和5%CO2混合氣體，給預(yù)初張力0.5 g，37 ℃恒溫孵育2 h，每20 min換液1次,待張力曲線平穩(wěn)后,測定血管環(huán)對NE的反應(yīng)性。血管環(huán)張力通過張力傳感器連接至八道生理記錄儀(Power Lab，AD Instrument)記錄。按累積濃度法向浴槽K-H液中依次加入NE，使其終濃度分別為0.001、0.01、0.1、1.0和10 μmol/L。記錄不同NE濃度下 SMA環(huán)產(chǎn)生的最大收縮力。以NE濃度和血管環(huán)單位組織濕重產(chǎn)生的張力(kg/g)作量-效曲線,曲線擬合法求NE的最大反應(yīng)(Emax)和pD2 (達到50%最大反應(yīng)時激動劑濃度的負對數(shù)-logEC50)，以NE的Emax和pD2 及量-效曲線評價血管對NE的反應(yīng)性。

將所取SMA血管環(huán)掛于注有K-H液中孵育2 h,方法同前,待張力曲線平穩(wěn)后,換用高鉀液(mmol/L：NaCl 2.7，KCl 120，NaHCO325，KH2PO41.03，MgSO4·7H2O 0.45，葡萄糖11.1，pH 7.4)孵育15 min，待張力曲線平穩(wěn)后，測定血管環(huán)對Ca2+的反應(yīng)性。按累積濃度法向浴槽高鉀液中依次加入CaCl2，使其終濃度分別為0.03、0.1、0.3、1、2、6、10和30 mmol/L，記錄不同Ca2+濃度下SMA環(huán)產(chǎn)生的最大收縮力。以Ca2+濃度和血管環(huán)單位組織濕重產(chǎn)生的張力(kg/g)作量-效曲線,曲線擬合法求Ca2+的Emax和pD2，以Ca2+反應(yīng)的Emax和pD2及量-效曲線評價血管對Ca2+的反應(yīng)性。

5統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1不同IPC方法對失血性休克大鼠24h存活率和存活時間的影響

各組大鼠體重和失血量間無顯著差異(P>0.05)。IPC Ⅰ組存活大鼠為6/10，與休克對照組的3/10和其它預(yù)處理組的2/10、4/10相比有顯著差異，且存活時間較休克對照組也明顯延長(P<0.05)。而IPC Ⅱ、Ⅲ組24 h存活率和存活時間與休克對照組相比則無明顯差異(P>0.05)?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們在后續(xù)實驗中選擇的IPC的方法為：夾閉腹主動脈1 min，開放5 min，重復(fù)3次,見圖1。

圖1不同IPC方法對失血性休克大鼠24h存活率和存活時間的影響

2IPC對失血性休克大鼠NE升壓效應(yīng)的影響

2.1IPC對失血性休克大鼠NE升壓效應(yīng)的影響 隨著休克時間的延長，休克對照組大鼠給予NE后MAP上升幅度明顯下降，與假手術(shù)組比較，在休克3 h和4 h，MAP上升幅度分別降至假手術(shù)組的36.1% 和24.5%,P<0.01。IPC可明顯增加休克后期NE升壓效應(yīng)，在休克3 h和4 h，IPC組大鼠給予NE后MAP上升幅度分別為休克對照組的1.84倍和2.19倍,見圖2A。

圖2IPC對失血性休克大鼠NE升壓效應(yīng)的影響(A)及IPC對在體SMA收縮反應(yīng)性(B)的影響

2.2IPC對失血性休克大鼠在體SMA對NE收縮反應(yīng)性的影響 隨著休克時間的延長，失血性休克后大鼠在體SMA對NE的收縮反應(yīng)性明顯下降，在休克3h和4 h，休克對照組大鼠SMA收縮反應(yīng)僅為假手術(shù)組的20.3%和15.2%；而IPC可明顯改善休克大鼠SMA對NE的收縮反應(yīng)性，在休克3 h和4 h，IPC組大鼠SMA對NE的收縮反應(yīng)性分別為休克對照組的2.62倍和3.41倍,見圖2B。

3IPC對失血性休克大鼠血管收縮反應(yīng)性和鈣敏感性的影響

3.1失血性休克后大鼠離體SMA收縮反應(yīng)性和鈣敏感性的變化 血管反應(yīng)性：與正常對照組比較，失血性休克后，腸系膜上動脈血管反應(yīng)性呈先升高后降低的雙相變化，即休克即刻血管反應(yīng)性升高，表現(xiàn)為量-效曲線左移，對NE的Emax增加為假手術(shù)組的142.3% (P<0.01)。隨著休克時間的延長，血管反應(yīng)性進行性下降，在休克后3 h和4 h，量-效曲線明顯右移，對NE的Emax顯著降低，分別為假手術(shù)組的42.5%和33.3%,P<0.01,見圖3 A、C、E。

圖3失血性休克后血管反應(yīng)性和鈣敏感性的變化

血管鈣敏感性：與正常對照組比較，失血性休克后，腸系膜上動脈血管鈣敏感性在休克即刻無明顯變化(P>0.05)。隨著休克時間的延長，鈣敏感性逐漸下降，休克30 min、1 h、2 h、3 h、4 h對鈣的Emax分別降低至假手術(shù)組的70.4%、70.3%、77.2%、59.5%和57.0% ，P<0.05或P<0.01,見圖3 B、D、F。

3.2IPC對失血性休克大鼠SMA血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響 在休克早期(休克即刻)，IPC組SMA對NE的收縮反應(yīng)性和鈣敏感性較失血性休克對照組明顯下降(P<0.05)，但與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)；在休克后期(休克2 h、3 h、4 h)，IPC組SMA對NE的收縮反應(yīng)性和鈣敏感性較失血性休克對照組顯著增加(P<0.05)，且IPC組SMA的鈣敏感性與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05),見圖4。

討 論

預(yù)處理是指在暴露于一種短期的應(yīng)激狀態(tài)(缺血、缺氧、熱休克等)及某種生化或藥理試劑后，組織對隨后損傷(如缺血、缺氧性損傷)所獲得的一種保護性反應(yīng)。大量研究顯示缺血和藥物預(yù)處理對心臟、腦、腎臟、骨骼肌、小腸[3-7]等器官的缺血再灌注

圖4IPC對失血性休克大鼠SMA血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響

損傷有明顯的保護作用，具有一定的器官普遍性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IPC和藥物預(yù)處理作為一種自我保護機制，可有效防止休克時組織低灌注和組織缺氧所致的休克后器官損傷和功能障礙。但目前關(guān)于預(yù)處理對失血性休克后血管功能是否有保護作用，尚不清楚。

IPC在其短暫缺血過程中釋放出神經(jīng)內(nèi)分泌或旁分泌物質(zhì)，如腺苷、緩激肽、兒茶酚胺、前列腺素等作用于相應(yīng)膜受體，這些受體激活后與跨膜G蛋白耦聯(lián)，通過不同的胞內(nèi)信號通路，活化PKC、PKG等，開放線粒體ATP敏感性鉀通道(mKATP)和線粒體鈣激活鉀通道(mBKCa)，關(guān)閉線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondral permeability transition pore,mPTP)，保護線粒體和細胞功能，發(fā)揮預(yù)處理保護作用。在對血管的預(yù)處理保護研究中發(fā)現(xiàn)，對離體的豬冠狀動脈血管環(huán)采用缺氧5 min，復(fù)氧10 min，重復(fù)2次的缺氧預(yù)處理方法，可顯著恢復(fù)隨后長時間缺氧導(dǎo)致的冠狀動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)性及由KCl 誘導(dǎo)血管收縮反應(yīng)性的損傷[8]。Zhen等[9]也報道了缺氧預(yù)處理和KATP通道開放劑KRN4884可以減輕由內(nèi)皮源性超極化因子介導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)。在本研究中，我們應(yīng)用不同的IPC方法，觀察失血性休克大鼠24 h存活率和存活時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)夾閉腹主動脈1 min，開放5 min，重復(fù)3次的IPC方法可明顯提高休克大鼠24 h存活率和存活時間。同時在體實驗發(fā)現(xiàn)IPC能顯著增加失血性休克大鼠NE的升壓效應(yīng)和休克大鼠SMA對NE的收縮反應(yīng)性，在休克3 h和4 h，IPC組大鼠給予NE后MAP上升幅度分別為休克對照組的1.84倍和2.19倍，SMA收縮幅度分別為休克對照組的2.62倍和3.41倍；離體實驗則發(fā)現(xiàn)IPC組在休克早期(休克即刻和30 min)血管對NE的收縮反應(yīng)性明顯低于休克對照組，這可能有助于組織灌注；而在休克中、后期(休克2 h、3 h、4 h)血管反應(yīng)性明顯高于休克對照組，這些結(jié)果均提示IPC誘導(dǎo)了休克后期血管低反應(yīng)性的保護效應(yīng)，并可通過改善血管反應(yīng)性降低休克所致的死亡率。

IPC是如何誘導(dǎo)失血性休克后期血管低反應(yīng)性保護效應(yīng)的呢？從休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生機制來看，目前認為除了受體失敏和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)膜超極化外，休克后VSMCs肌肉收縮蛋白鈣失敏在休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生中也具有重要作用[10]。本研究結(jié)果也顯示失血性休克后大鼠SMA鈣敏感性在休克后30 min即出現(xiàn)明顯下降，之后隨著休克時間的延長呈進行性下降。而IPC后休克后期鈣敏感性同血管反應(yīng)性一樣均較休克對照組明顯升高，提示IPC可能通過恢復(fù)鈣敏感性發(fā)揮對血管反應(yīng)性的保護作用。但IPC是如何恢復(fù)鈣敏感性，是否與調(diào)節(jié)鈣敏感性的重要分子Rho激酶、PKC和PKG有關(guān)，還有待進一步研究。

我們的實驗顯示IPC后休克后期血管反應(yīng)性較休克對照組明顯升高，但仍明顯低于正常對照組；而血管鈣敏感性較休克對照組明顯升高，接近正常對照組水平，這提示在休克后期血管反應(yīng)性下降的發(fā)生機制中，除了非鈣依賴性途徑/鈣敏感性途徑外，鈣依賴性途徑調(diào)節(jié)的血管平滑肌收縮力下降在其中可能也有重要作用。

[1] Liu LM, Dubick MA. Hemorrhagic shock-induced vascular hyporeactivity in the rat: relationship to gene expression of nitric oxide synthase, endothelin-1, and select cytokines in corresponding organs[J]. J Surg Res, 2005,125(2):128-136.

[2] Rubino A,Yellon DM. Ischaemic preconditioning of the vasculature: an overlooked phenomenon for protecting the heart? [J].Trends Pharmacol Sci, 2000, 21(6):225-230.

[3] Rodrigo GC, Samani NJ.Ischemic preconditioning of the whole heart confers protection on subsequently isolated ventricular myocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008, 294(1):H524-H531.

[4] Joo JD,Kim M,D’Agati VD, et al. Ischemic preconditioning provides both acute and delayed protection against renal ischemia and reperfusion injury in mice[J]. J Am Soc Nephrol,2006,17(11):3115-3123.

[5] Jang JH,Kang KJ, Kang Y, et al.Ischemic preconditioning and intermittent clamping confer protection against ischemic injury in the cirrhotic mouse liver[J]. Liver Transpl,2008,14(7):980-988.

[6] Bobryshev P, Bagaeva T, Filaretova L. Ischemic preconditioning attenuates gastric ishchemia-reperfusion injury through involvement of glucocorticoids[J]. J Physiol Pharmacol,2009,60(Suppl 7):155-160.

[7] Sola A,De Oca J,Gonzlez R,et al. Protective effect of ischemic preconditioning on cold preservation and reperfusion injury associated with rat intestinal transplantation[J].Ann Surg,2001,234(1):98-106.

[8] Kuzner J, Drevensek G, Gersak B, et al. Hypoxic and pharmacological preconditioning preserves vasomotor response of porcine coronary artery[J]. Pol J Pharmacol,2004,56(6): 789-797.

[9] Ren Z,Yang Q,Floten HS,et al. Hypoxic preconditioning in coronary microarteries:role of EDHF and K+channel openers[J]. Ann Thorac Surg,2002,74(1):143-148.

[10]Xu J, Liu L. The role of calcium desensitization in vascular hyporeactivity and its regulation after hemorrhagic shock in the rat[J]. Shock, 2005,23(6):576-581.

《中國病理生理雜志》投稿須知

本刊為中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會主管，中國病理生理學(xué)會主辦、暨南大學(xué)出版、國內(nèi)外公開發(fā)行的綜合性病理生理學(xué)高級學(xué)術(shù)刊物，主要刊登有關(guān)病理生理學(xué)方面的論著(包括實驗研究和臨床研究)、專題綜述、學(xué)術(shù)動態(tài)、臨床生理專題講座、教學(xué)經(jīng)驗、研究技術(shù)和實驗方法(包括疾病模型和實驗動物)創(chuàng)新、書刊評論、教學(xué)科研儀器和藥品的評價等。歡迎國內(nèi)、外科研工作者投稿。

文稿應(yīng)選題新穎，論點鮮明，論據(jù)(數(shù)據(jù))可靠，結(jié)論明確，具有創(chuàng)新性和較強的科學(xué)性和邏輯性。文句要求嚴謹、明確、通順達意、重點突出。用字應(yīng)規(guī)范，標(biāo)點符號使用準確。文稿可用中文或英文撰寫，英文請附上相應(yīng)的中譯文。論著篇幅原則上不超過6 000字，綜述一般不超過7 000字，短篇論著、研究技術(shù)及實驗方法創(chuàng)新一般不超過3 000字(均包括圖表及參考文獻)。撰稿格式的詳細要求請看本刊網(wǎng)站(http://www.cjpp.net)中的投稿須知。學(xué)術(shù)討論、書刊評論、會議紀要等視具體情況而定。

本刊采用網(wǎng)上投稿形式。請先登錄本刊網(wǎng)站，進入“作者投稿系統(tǒng)”，按照網(wǎng)頁上的提示先進行用戶注冊, 然后進行網(wǎng)上投稿。網(wǎng)上投稿完成后，編輯部會用電子郵件的方式將稿件編號和收稿回執(zhí)發(fā)送給通訊作者。通訊作者收到論文回執(zhí)后，請?zhí)顚憽罢撐陌鏅?quán)轉(zhuǎn)讓協(xié)議書”(請在本刊網(wǎng)站下載后打印)，經(jīng)所有作者簽名后, 連同單位推薦信，盡快郵寄給本刊編輯部。

《中國病理生理雜志》編輯部

Effectofischemicpreconditioningonvascularreactivityandcalciumsensitivityinhemorrhagicshockrats

HU Yi1, LI Tao2, XU Jing2, TANG Xiao-feng1, LIU Liang-ming2

(1DepartmentofAnesthesiology,2StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnsandCombinedInjury,Department2,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:liangmingliu@yahoo.com)

AIM: To investigate the effect of ischemic preconditioning (IPC) on vascular reactivity and calcium sensitivity during hemorrhagic shock.METHODSAppropriate method of IPC was selected by observing the effect of different strategies of IPC on the survival time and the survival rate in hemorrhagic shock rats. The effect of IPC on the pressor effect of norepinephrine (NE, 3 μg/kg) and the contractile response of superior mesenteric artery (SMA) to NE and calciuminvivoandinvitrowere observed.RESULTSAmong 3 strategies of IPC, 3 cycles of abdominal aorta occlusion for 1 min and loosing for 5 min increased the survival time and 24 h survival rate significantly, which was superior to the other two IPC methods.Invivo, IPC significantly increased the pressor response to NE and the contractile response of SMA to NE (P<0.01).Invitro, IPC significantly improved the reactivity of SMA to NE and Ca2+. The Emaxvalues of SMA to NE and Ca2+in IPC group were significantly higher than that in shock control group (P<0.01).CONCLUSIONIschemic preconditioning reverses Shock-induced vascular hyporeactivity via improving calcium sensitivity of the vasculatures.

Ischemic preconditioning; Shock,hemorrhagic; Vascular reactivity; Calcium sensitivity

R363

A

1000-4718(2011)03-0437-06

2010-08-02

2010-12-17

國家杰出青年基金資助項目(No.30625037)

△通訊作者Tel:023-68757421；E-mail: liangmingliu@yahoo.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.004