狄 楓， 王良興， 沈巨信， 高偉紅

(1 紹興市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 紹興312000;2溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肺科中心，浙江 溫州325000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)［1］，肺動(dòng)脈高壓是其終末階段。肺動(dòng)脈高壓的動(dòng)物模型已經(jīng)證實(shí)促炎因子和一些趨化因子與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生有關(guān)［2，3］。CX3CL1(fractalkine，F(xiàn)KN)是趨化因子CX3C 亞族里的唯一成員，也是唯一的一種既有可溶形式也有膜結(jié)合形式的趨化因子，既有趨化性蛋白的功能也有細(xì)胞黏附分子的功能。本實(shí)驗(yàn)在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型上，觀察FKN 的表達(dá)情況，探討FKN 在肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中的作用和可能的機(jī)制，以及觀察葛根素的治療效果。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠30 只(溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重(body weight，BW)270－310g，在恒溫26℃，相對(duì)濕度50%－60%清潔環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 試劑和藥品 野百合堿(monocrotaline)購(gòu)于日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，葛根素(puerarin)由浙江康恩貝制藥股份有限公司出品(批號(hào)為090103;規(guī)格:2 mL∶0.1 g)，大鼠fractalkine ELISA 試劑盒購(gòu)于晶美生物工程有限公司。RT－PCR試劑盒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。免疫組化試劑購(gòu)于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。Fractalkine 兔抗大鼠多克隆抗體購(gòu)自BioVision。其余試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組 將30 只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組:(1)溶劑對(duì)照組(C 組，10 只)，采用無(wú)水乙醇與生理鹽水2∶8 比例混合單次腹腔注射;(2)野百合堿模型組(M組，10 只)，采用上述溶劑配成的1. 0% 野百合堿溶液以50 mg/kgBW 的劑量單次腹腔注射后飼養(yǎng)3 周;(3)葛根素干預(yù)組(M+ P 組，10 只)，在注射野百合堿溶液后每晨以40 mg/kgBW 劑量腹腔注射飼養(yǎng)3 周。余飼養(yǎng)條件各組相同。動(dòng)物飼養(yǎng)到規(guī)定時(shí)間后，稱(chēng)量體重，以5%水合氯醛400 mg/kg 劑量腹腔注射麻醉，將聚乙烯導(dǎo)管(OD 1.1 mm，ID 0.8 mm)從右頸外靜脈插入右心室，記錄右心室壓力波形后插入肺動(dòng)脈固定記錄肺動(dòng)脈壓力波形，另一聚乙烯導(dǎo)管從左頸總動(dòng)脈插入固定記錄頸總動(dòng)脈壓力波形，ML870PowerLab 8/30數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)及MLS023Chart 軟件計(jì)算肺動(dòng)脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)、右心室平均壓(mean right ventricle pressure，mRVP)和頸動(dòng)脈平均壓(mean carotid arterial pressure，mCAP)。放血處死動(dòng)物后，分離心臟，PBS 沖洗，10%中性甲醛液中固定后，把心臟剪開(kāi)成右心室壁(right ventricle，RV)和左心室(left ventricle，LV)加室間隔(septum，S)兩部分，濾紙吸干液體后分別用電子天平稱(chēng)重，計(jì)算兩者的比值RV/(LV+S)來(lái)反映右心室重量的變化。

2.2 光鏡標(biāo)本制作及觀察 分離左肺組織，10%中性福爾馬林液中固定充分，左肺門(mén)水平橫切，制備石蠟包埋組織切片，厚度4μm，分別行HE 染色、醛品紅法彈力纖維染色，每只大鼠選1 張肺組織切片，每張切片隨機(jī)選取直徑(50－200)μm肺細(xì)小動(dòng)脈各6 支(50－100 μm 2 只，100－150 μm 2 只，150－200 μm 2 只)，用Image－Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定平均血管總面積(外彈力板以?xún)?nèi))、血管腔面積(內(nèi)膜表面以?xún)?nèi))，計(jì)算肺細(xì)小動(dòng)脈管壁面積(vessel wall area，WA)/管總面積(total area，TA)(WT/TA)，并測(cè)定肺細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)外彈力板之間的中膜厚度(thickness of pulmonary artery media，PAMT)。

2.3 血漿可溶性fractalkine(sFKN)測(cè)定 應(yīng)用ELISA 試劑盒檢測(cè)大鼠血漿sFKN 水平，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值用SPSS 11.5 軟件擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)本吸光度值計(jì)算出濃度。

2.4 RT－PCR 法檢測(cè)肺組織FKN mRNA 的表達(dá) 動(dòng)物放血處死后，迅速取右下肺新鮮組織，無(wú)菌去酶1 ×PBS 水洗去血污，即刻置液氮中保存。Trizol 一步法提取組織RNA 并純度鑒定及定量，使其終濃度為1 g/L。反應(yīng)在200 μL PCR 薄壁管(RNase free)中進(jìn)行。FKN 上游引物5'－CCCTGAGACACCCGTTTC－3'，下游引物5'－AGTGACTATTCATGTTGATAAGGG－3，目標(biāo)片段524 bp;GAPDH 上游引物5'－TTCCAGGAGCGAGATCCC－3'，下 游 引 物5'－CAGGGGGGCTAAGCAGTT－3'，目標(biāo)片段252 bp。擴(kuò)增條件為94 ℃30 s→54 ℃30 s→72 ℃1 min，熱循環(huán)30 次，72 ℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后Gel－Pro Analyzer 軟件分析，F(xiàn)KN mRNA/GAPDH mRNA 的比值即為FKN mRNA 的相對(duì)含量，每個(gè)樣本重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，取其平均值。

2.5 FKN 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 肺組織經(jīng)10%中性甲醛液充分固定后。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后抗原修復(fù)，Ⅰ抗為FKN 兔抗大鼠多克隆抗體，Ⅱ抗為山羊抗兔的IgG抗體－HRP 多聚體，0.05%DAB－H2O2顯色，蘇木素淡染細(xì)胞核，脫水透明后中性樹(shù)膠封片。不滴加Ⅰ抗的片子作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色，每只大鼠選1 張肺組織切片，每張切片隨機(jī)選取直徑為50－200 μm 的肺細(xì)小動(dòng)脈5 支，用Image－Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定管壁平均吸光度(A)反映肺動(dòng)脈壁上FKN 的相對(duì)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 形態(tài)學(xué)檢查

光鏡下示C 組肺細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞扁平連續(xù)，內(nèi)彈力板自然彎曲，平滑肌層未見(jiàn)明顯增厚，管壁均勻一致。M 組肺細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)皮部分脫落，血管肌化明顯，內(nèi)彈力板進(jìn)一步扭曲甚至斷裂，管壁明顯增厚，部分小動(dòng)脈閉塞，血管周?chē)粤馨图?xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，部分成團(tuán)。M +P 組肺細(xì)小動(dòng)脈較M 組血管肌化減輕，內(nèi)彈力板扭曲減少，管壁增厚好轉(zhuǎn)，管腔狹窄不明顯，血管周?chē)仔约?xì)胞減少，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Pulmonary arteriole of rats in each group. A:control group;B:monocrotaline model group;C:monocrotaline +puerarin group (HE staining，×400)圖1 各組肺細(xì)小動(dòng)脈HE 染色

Figure 2. RT－PCR electrophoresis strip of FKN in lung tissues圖2 各組大鼠肺組織FKN m RNA 表達(dá)

2 各組大鼠mPAP、mRVP 、mCAP、RV/(LV +S)%、WA/TA 和PAMT 的比較

M 組mPAP、mRVP 、RV/(LV+S)、WA/TA 和PAMT 均顯著高于C 組，說(shuō)明大鼠肺動(dòng)脈壓力增高，右心室肥大，血管壁增厚，證實(shí)模型制造成功。M + P 組RV/(LV + S)、WA/TA、PAMT 較M 組顯著降低。M+P 組mPAP 和mRVP 與M 組比較有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異。反映體循環(huán)的頸動(dòng)脈平均壓(mCAP)在各組之間無(wú)顯著差異(F=0.633，P ＞0.05)，見(jiàn)表1。

3 各組大鼠血漿sFKN 濃度、肺組織FKN mRNA 相對(duì)含量及肺動(dòng)脈壁膜結(jié)合型FKN 表達(dá)比較

M 組血漿sFKN 濃度、肺組織FKN mRNA 含量和肺動(dòng)脈壁FKN 蛋白含量大于C 組，M+P 組的這些指標(biāo)均小于M 組，差異顯著，見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠mPAP、mRVP 、mCAP、RV/(LV+S)、WA/TA 和PAMT 比較Table 1. Comparison of mPAP，mRVP，mCAP，RV/(LV+S)，WA/TA and PAMT in the three groups(±s.n=8)

表1 各組大鼠mPAP、mRVP 、mCAP、RV/(LV+S)、WA/TA 和PAMT 比較Table 1. Comparison of mPAP，mRVP，mCAP，RV/(LV+S)，WA/TA and PAMT in the three groups(±s.n=8)

1 mmHg=0.133 kPa;＊＊P ＜0.01 vs C group;##P ＜0.01 vs M group.C:control:M:monocrotaline model;M+P:monocrotaline+puerarin.

Group mPAP(mmHg) mRVP(mmHg) mCAP(mmHg)RV/(LV+S)(%) WA/TA PAMT(μm)C 90 0.45 ±0.07 13.91 ±1.51 M 26.04 ±5.03＊＊ 22.17 ±5.63＊＊ 83.54 ±13.08 59.52 ±12.86＊＊ 0.87 ±0.04＊＊ 36.48 ±3.81＊＊M+P 22.34 ±3.76 21.42 ±2.98 79.33 ±16.38 40.32 ±5.24## 0.69 ±0.08## 26.12 ±3.40 12.93 ±1.93 11.66 ±1.81 76.08 ±9.57 23.33 ±2.##

表2 各組大鼠血漿sFKN 濃度、肺組織FKN mRNA 相對(duì)含量和肺動(dòng)脈壁膜結(jié)合型FKN 的變化Table 2. Changes of sFKN in plasma，F(xiàn)KN mRNA in lung tissue and FKN protein in pulmonary artery wall in each group(±s.n=8)

表2 各組大鼠血漿sFKN 濃度、肺組織FKN mRNA 相對(duì)含量和肺動(dòng)脈壁膜結(jié)合型FKN 的變化Table 2. Changes of sFKN in plasma，F(xiàn)KN mRNA in lung tissue and FKN protein in pulmonary artery wall in each group(±s.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs C group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs M group.

Group sFKN(ng/L)FKN mRNA/ GAPDH mRNA FKN protein C 412.09±57.38 0.11±0.06 0.171±0.010 M 1 078.02±254.05＊＊ 0.64±0.04＊＊ 0.198±0.019＊＊M+P 465.17±188.80## 0.28±0.08## 0.181±0.016#

4 血漿sFKN、肺組織FKN mRNA、肺動(dòng)脈壁膜結(jié)合型FKN蛋白與PAMT、RV/(LV+S)相關(guān)性分析

sFKN 與PAMT 呈正相關(guān)(r =0.719，P ＜0.01)，與RV/(LV+S)呈正相關(guān)(r=0.685，P ＜0.01)，F(xiàn)KN mRNA 與PAMT呈正相關(guān)(r=0.882，P ＜0.01)，與RV/(LV+S)呈正相關(guān)(r=0.830，P ＜0. 01)，F(xiàn)KN 與PAMT 呈正相關(guān)(r =0. 599，P ＜0.01)，與RV/(LV+S)呈正相關(guān)(r=0.664，P ＜0.01)。

討 論

COPD 與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，具有氣流受限的特征［1］。其發(fā)病的終末環(huán)節(jié)為肺動(dòng)脈高壓的形成，而繼發(fā)的肺動(dòng)脈高壓是COPD 發(fā)展至肺心病的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，死亡率大幅度上升。肺動(dòng)脈高壓的形成機(jī)制很復(fù)雜，目前觀點(diǎn)認(rèn)為是各種內(nèi)外環(huán)境的刺激因素作用于有遺傳易感性的個(gè)體，最終導(dǎo)致肺小動(dòng)脈異常收縮和血管重建，使肺動(dòng)脈壓力增高。近年來(lái)對(duì)炎癥與血管炎、血管硬化的研究方興未艾，近期研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一種由各種原因損傷內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致的特殊形式的動(dòng)脈壁慢性炎癥［4］，很多實(shí)驗(yàn)也都已經(jīng)觀察到在肺動(dòng)脈高壓的患者和動(dòng)物模型肺血管的復(fù)合性損傷中，血管周?chē)仔约?xì)胞如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，說(shuō)明炎癥細(xì)胞參與了肺動(dòng)脈高壓中的血管損傷［5］。臨床上無(wú)明顯缺氧的輕度COPD 患者，甚至肺功能正常的吸煙者都已出現(xiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)膜增厚和以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明炎癥在COPD 引起的肺動(dòng)脈高壓過(guò)程中是初始因素，而這些白細(xì)胞的運(yùn)輸包括滾動(dòng)、黏附、外滲等運(yùn)動(dòng)都是在趨化因子的趨化作用下完成的。FKN 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的唯一一種可以以膜結(jié)合形式和可溶性形式2 種形式存在的趨化因子，膜結(jié)合的FKN 受炎癥細(xì)胞因子(如TNF－α、IL－1、IFN－γ)的激活主要表達(dá)在內(nèi)皮和上皮細(xì)胞表面，它本身具有整合蛋白的功能，介導(dǎo)的黏附可以是整合素非依賴(lài)途徑，膜結(jié)合形式不僅能介導(dǎo)俘獲快速血流中的CX3CR1 陽(yáng)性白細(xì)胞并且還能激活它們［6－8］。但不同于其它的趨化因子，F(xiàn)KN在被溶蛋白性裂解后可以可溶性形式釋放［9］，在正常狀態(tài)下，可溶性FKN 的功能還不確定，在多種慢性炎癥疾病中可以觀察到血清FKN 的升高［10，11］，同時(shí)參與血管炎的病理過(guò)程［12］，在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人中，伴有血管炎的患者血清FKN 的含量明顯高于不伴有血管炎的患者［13］，在韋格納肉芽腫病人血清中，F(xiàn)KN 含量明顯高于健康對(duì)照者。同時(shí)血清中FKN 含量的增高能增加外周血單核細(xì)胞CX3CR1 的表達(dá)，從而加強(qiáng)這些受體陽(yáng)性細(xì)胞的趨化和黏附，這些變化直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷［14］。體外研究發(fā)現(xiàn)sFKN 對(duì)單核細(xì)胞和T細(xì)胞呈現(xiàn)很好的趨化活性，指引這些細(xì)胞游走到特定的血管部位。由于其結(jié)構(gòu)和功能的獨(dú)特性，F(xiàn)KN 越來(lái)越受到人們的關(guān)注，被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)中單核細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞募集到血管壁的過(guò)程中起到了關(guān)鍵性的作用。CX3CR1 在嚴(yán)重原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者體內(nèi)循環(huán)T 細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)，特別在CD4 陽(yáng)性的T 細(xì)胞亞群，血漿中可溶性的FKN 濃度較對(duì)照組增高，肺組織FKN mRNA 的表達(dá)較對(duì)照組有顯著增高［15］。我們的實(shí)驗(yàn)在肺動(dòng)脈高壓的大鼠模型上也觀察到肺組織和肺動(dòng)脈壁上的FKN 表達(dá)增加，血漿中可溶FKN 增加。

葛根素系豆科植物野葛干燥根中的提取物，其主要成分為8－D－吡喃葡萄糖－4，7－二羥基異黃酮苷，具有擴(kuò)張血管、抗凝、改善微循環(huán)、清除氧自由基、抑制平滑肌細(xì)胞增生等作用［16］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)葛根素還能抑制組織缺血再灌注損傷后炎癥細(xì)胞聚集和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［17］，另有研究證明葛根素能有效改善慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺血管重建、降低肺動(dòng)脈高壓及右心室肥大［18，19］，但具體機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型中觀察葛根素對(duì)肺動(dòng)脈高壓的干預(yù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)葛根素干預(yù)組RV/(LV +S)有明顯下降，mCAP 無(wú)改變，提示葛根素可以抑制野百合堿誘導(dǎo)的右心室重構(gòu)的發(fā)展，而對(duì)體循環(huán)無(wú)明顯影響，同時(shí)光鏡下發(fā)現(xiàn)葛根素可以抑制肺細(xì)小動(dòng)脈WA/TA 和PAMT 的增加，血管周?chē)装Y細(xì)胞減少，說(shuō)明葛根素在野百合堿模型中具有抑制肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中肺動(dòng)脈重建和減輕肺血管周?chē)装Y的作用。

總之，COPD 的病因復(fù)雜，且多因素相互影響，COPD 繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制涉及功能性、解剖學(xué)因素以及血容量增多和血黏度增加等方面。炎癥細(xì)胞和相關(guān)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)參與肺血管重建的機(jī)制日益受到重視，我們的實(shí)驗(yàn)首次采用更符合COPD 肺動(dòng)脈高壓炎性環(huán)境的野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓時(shí)FKN 在血漿、肺組織和肺細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)皮上表達(dá)增強(qiáng)，并且與肺動(dòng)脈壁厚度的變化密切相關(guān)，葛根素有明顯的下調(diào)FKN 和緩解肺動(dòng)脈高壓的作用。這可能有助于進(jìn)一步闡明COPD 繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓的形成機(jī)制，同時(shí)也為葛根素在治療肺動(dòng)脈高壓患者上的推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

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