肖 軍， 趙贊棟， 史占軍△， 梁錦前， 吳志宏， 邱貴興

(1南方醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病外科， 廣東 廣州 510515；2北京協(xié)和醫(yī)院骨科， 北京 100730)

CoREST基因在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達、分布和意義*

肖 軍1， 趙贊棟1， 史占軍1△， 梁錦前2， 吳志宏2， 邱貴興2

(1南方醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病外科， 廣東 廣州 510515；2北京協(xié)和醫(yī)院骨科， 北京 100730)

目的觀察RE-1元件輔助沉默因子(CoREST)基因在正常和骨關(guān)節(jié)炎(OA)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達和分布，分析CoREST基因表達下調(diào)對OA的病理意義。方法取材膝關(guān)節(jié)正常(n=10)和OA(n=12)軟骨組織，提取軟骨細胞并包埋制備切片，應用real-time PCR技術(shù)對比CoREST基因在正常和OA軟骨細胞中表達水平的總體差異，應用原位雜交技術(shù)觀察CoREST基因在正常/OA軟骨表、中、深各層組織中的表達和分布的特點。結(jié)果CoREST基因在OA軟骨細胞中的表達水平顯著降低64.6%(P<0.01)。CoREST基因廣泛表達于正常軟骨組織的表層、中層和深層，以中層表達最為顯著，其次為深層和表層。在OA軟骨組織中，CoREST基因在淺層細胞簇部分細胞中表達水平升高，在深層潮線狀細胞柱中表達水平普遍降低。結(jié)論CoREST基因在正常和OA軟骨組織細胞中的差異表達和分布與文獻報道的X型膠原基因的組織學表達一致。結(jié)合前期研究成果，我們認為CoREST的生物功能可能與OA軟骨細胞的終末分化相關(guān)。

RE-1元件輔助沉默因子； 骨關(guān)節(jié)炎； 軟骨細胞； 原位雜交

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種以軟骨退變、磨損為病理表現(xiàn)的疾病[1]。軟骨細胞終末分化，導致合成/分解代謝負平衡，甚至凋亡，是OA軟骨缺損修復困難和OA進展的關(guān)鍵原因之一[2]。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)OA軟骨細胞表達RE-1元件輔助沉默因子[RE-1 silencing transcription factor (REST) corepressor, CoREST]的水平較正常軟骨細胞顯著降低，誘發(fā)軟骨細胞表型基因的表達呈現(xiàn)特征性變化，提示CoREST是OA軟骨細胞終末分化的始動因子或軟骨細胞合成代謝的調(diào)節(jié)因子[3]。本文旨在通過組織學切片進一步觀察CoREST基因在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達和分布特點，了解CoREST在OA發(fā)生和發(fā)展過程中的病理意義。

材 料 和 方 法

1資料及分組

OA膝關(guān)節(jié)軟骨組織取材自接受膝關(guān)節(jié)表面置換的OA患者[n=12，男性2人，女性10人，平均年齡62.7歲(53-72歲)]。OA診斷依據(jù)美國風濕病協(xié)會2001年版指南。正常軟骨組織取材于遺體捐獻患者[n=10，男性2人，女性8人，平均年齡65.1歲(60-71歲)]，排除膝關(guān)節(jié)疾病病史。軟骨標本取材均經(jīng)過患者或家屬知情同意。

2軟骨細胞總RNA的提取和鑒定

液氮速凍后，稱取約100 mg軟骨組織，研磨成粉末。加入含β-巰基乙醇的RLC緩沖液，應用RNeasy Fibrous Tissue Mini kit(Qiagen)提取組織總RNA。操作步驟按照試劑盒說明書進行。最后步驟采用13 μL DEPC H2O洗脫。所獲RNA溶液測量A280/260比值確認純度合格后，剩余約11 μL RNA溶液直接作為模板進行第1鏈cDNA的合成。

3第1鏈cDNA的合成

反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA采用ReverTra Ace -α-TM kit (Toyobo)。反應體系構(gòu)成為：RNA溶液11 μL，oligo(dT) 1 μL，5×緩沖液 4 μL，10 mmol/L dNTP混合物 2 uL，ReverTra Ace(1×108U/L)1 μL，RNA酶抑制劑1 μL。反應條件為：30 ℃ 10 min；42 ℃ 20 min；95 ℃ 5 min；4 ℃終止反應。

4Real-timePCR

CoREST和內(nèi)參照GAPDH引物(表1)通過Roche公司在線程序Universal ProbeLibrary for Human(https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/acenter.jsp?id=030000)設計。引物特異性通過Blast程序(NCBI GenBank)驗證。

表1 Real-time PCR引物

Real-time PCR試劑選用QuantiTectTMSYBR? Green PCR (Qiagen)。反應條件：94 ℃ 60 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)40次。反應體系構(gòu)成：cDNA模板2 μL、SYBR master Mix 10 μL、上下游引物(300 nmol/L)各1 μL、DEPC H2O 6 μL。PCR反應首先采用Roter-Gene 3000(Roche)進行，通過雙標準曲線法比較CoREST和GAPDH引物的擴增效率。確認擴增效率差異僅0.04后，改用Applied Biosystems 7500系統(tǒng)(ABI)對比CoREST基因表達在正常和OA組軟骨細胞之間的差異，實驗重復3次。組間差異應用2-ΔΔCt法計算。

5探針的合成與標記

CoRESTmRNA寡核苷酸探針應用Primer 3.0軟件設計，序列為5′-CGAG GACTAAAACT AGTGTGATGG ATCGCCATGC CCGGAAACAA AAACGGGAGC-3′。序列特異性經(jīng)過BLAST(同前)驗證。探針采用地高辛5′端標記，由Invitrogen合成。

6軟骨組織原位雜交

軟骨組織變性、洗滌后直接包埋石蠟，切片厚度4 μm, 貼片后經(jīng)72 ℃烘烤3 h。二甲苯、乙醇梯度入水，蛋白酶K (100 mg/L ) 37 ℃消化15 min。4% 多聚甲醛固定10 min，2×SSC、三蒸水洗滌后逐級乙醇脫水。滴加預雜液，42 ℃預雜2 h后，滴加40-60 μL變性的雜交液(探針濃度2 mg/L), 45 ℃雜交過夜。室溫下2×SSC洗滌5 min 2次，0.5×SSC洗滌15 min 2次，0.2×SSC洗滌15 min 2次，洗去非特異性結(jié)合。滴加封閉液，37 ℃孵育30 min，滴加1∶100稀釋的兔抗地高辛-BSA抗體。37 ℃孵育60 min，0.1 mol/L PBS洗滌5 min×4次。添加DAB顯色45 s，充分水洗后蘇木素復染。封片后顯微鏡下觀察原位雜交結(jié)果，圖像資料導入Image Pro 6.0軟件進行分析。CoREST基因陽性表達細胞判定標準為：細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色的顆?；虬邏K。

7統(tǒng)計學處理

CoREST基因表達在正常/OA軟骨細胞間的差異和CoREST基因在軟骨組織各層表達水平的差異均采用獨立樣本的t檢驗進行組間對比統(tǒng)計學分析。

結(jié) 果

1CoREST基因在正常軟骨和OA軟骨細胞中的差異表達

Real-time PCR結(jié)果顯示OA軟骨細胞中CoREST的表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。OA軟骨細胞中CoREST表達水平相比正常軟骨細胞平均降低64.6%，P<0.01，差異顯著，見圖1。

2CoREST基因在軟骨組織中的表達和分布

CoREST基因在OA軟骨組織中廣泛表達于軟骨各層(表層、中層和深層)，其中，中層軟骨細胞中的CoREST表達量最高，細胞胞漿普遍呈棕黃色染色。深層細胞潮線內(nèi)軟骨細胞CoREST表達量稍少于中層，表現(xiàn)為部分軟骨細胞胞漿呈現(xiàn)淺黃色淡染。在表層軟骨細胞中，CoREST表達量最少，部分細胞胞漿呈現(xiàn)空泡樣改變，CoREST表達缺如。CoREST在正常軟骨組織細胞中的mRNA的表達量總體呈現(xiàn)：中層>深層>表層趨勢，見圖2A、B。

OA軟骨表現(xiàn)為表層組織不同程度磨損、裂縫或纖維化。在磨損或裂縫的表面下，淺層軟骨細胞呈現(xiàn)團簇樣增生，而深層細胞量減少，潮線結(jié)構(gòu)趨于不明顯。在表層團簇樣增生的細胞中，部分細胞呈現(xiàn)濃染的棕黃色胞漿，說明CoREST高表達。但是，這種表達并不均一，在同一細胞簇的部分其它細胞中，CoREST染色較弱甚至呈現(xiàn)陰性表達。在深層呈潮線排列的軟骨細胞中，CoREST染色陽性細胞呈零星分布，整體表達豐度明顯低于OA軟骨表層和正常軟骨,見圖3。

缺損灶周圍的軟骨區(qū)域，軟骨細胞雜亂增生，排列失去層次和規(guī)律，軟骨基質(zhì)呈現(xiàn)纖維化。在這些區(qū)域，CoREST基因在絕大部分軟骨細胞中表達缺如，細胞胞漿無陽性染色信號，見圖4A。在軟骨缺損灶底部，CoREST基因表達缺如，見圖4B。

圖1正常和OA軟骨組織細胞中CoREST基因表達水平對比

Figure 2.CoRESTgene expression in normal cartilage(×100).

圖2CoREST基因在正常軟骨組織中的表達

Figure 3.CoRESTgene expression in osteoarthritic cartilage(×100)

圖3CoREST基因在OA軟骨組織中的表達

Figure 4.CoRESTgene expression in the region around the cartilage defect (4A,×100;4B,×200).

圖4CoREST基因在OA軟骨缺損灶周圍組織中的表達

討 論

CoREST的經(jīng)典定義是一種神經(jīng)元表型調(diào)控因子，它以CoREST/ REST復合體的作用模式，發(fā)揮對神經(jīng)元分化的調(diào)控[4]。在非神經(jīng)元細胞種屬中，CoREST被認為通過抑制神經(jīng)元表型基因的表達，參與維持這些細胞表型的特異性和穩(wěn)定性[5]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)CoREST參與了對OA軟骨細胞表型的調(diào)控。CoREST在OA軟骨細胞中表達下調(diào)，導致軟骨細胞正常分化表型II型膠原和aggrecan表達水平下降，而終末分化表型X型膠原表達水平升高，提示CoREST是OA軟骨細胞終末分化的始動因子，或軟骨細胞合成代謝的調(diào)控因子[3]。

本文在基因水平上驗證CoREST在OA軟骨細胞中的差異表達，并觀察CoREST基因在不同程度病損的OA軟骨組織，以及軟骨組織不同區(qū)域表達水平的差異，旨在通過觀察CoREST與軟骨組織細胞區(qū)域性病理變化之間的相關(guān)性，提供CoREST參與調(diào)控OA軟骨細胞病理改變的線索。實驗結(jié)果首先證實CoREST基因表達水平在OA軟骨細胞中顯著下降，幅度達到64.6%。

原位雜交發(fā)現(xiàn)CoREST在OA軟骨組織中的表達并非整體降低。CoREST基因廣泛表達于正常軟骨組織的表層、中層和深層，其中，中層軟骨細胞中CoREST表達豐度最高，深層相對較低，表層表達相對較少。在OA軟骨中，磨損的軟骨表層被增生的細胞團簇所替代，同時，深層潮線狀排列的細胞數(shù)量較正常減少。雖然CoREST在OA軟骨的表達總體下調(diào)，但在OA軟骨組織淺層增生的細胞團簇中，大部分細胞卻呈現(xiàn)CoREST基因的高表達，雖然這種表達并不均一，團簇內(nèi)部分細胞表達CoREST甚至缺如。在OA軟骨深層潮線狀排列的細胞中，大部分細胞均表現(xiàn)為CoREST陰性表達或低表達。在纖維化嚴重的區(qū)域和OA軟骨缺損區(qū)域，CoREST表達水平才整體下降。

可見，CoREST基因表達下降主要集中在OA軟骨組織的深層細胞。結(jié)合前期的研究成果，我們分析CoREST在組織深層OA軟骨細胞的下調(diào)表達將誘導深層軟骨細胞上調(diào)表達X型膠原基因，同時抑制局部II型膠原和蛋白多糖的合成。該分析結(jié)果與Aigner等[6]關(guān)于X型膠原基因在OA軟骨組織中的分布相符-通過原位雜交技術(shù)，Aigner證實X型膠原基因主要表達于OA軟骨組織的深層細胞，而在表層增生的細胞團簇內(nèi)中表達較少。另一方面，Nelson等[7]和Pfander等[8]分別通過免疫組織化學技術(shù)，證實OA軟骨細胞上調(diào)表達II型膠原，主要集中于組織深層的軟骨細胞，這種現(xiàn)象不能用我們所觀察到的CoREST在OA軟骨組織各層之間的差異表達來解釋。

綜上所述，本文原位雜交結(jié)果進一步支持將CoREST的生物功能與OA軟骨細胞X型膠原基因表達的調(diào)控以及軟骨細胞的終末分化的調(diào)控相關(guān)聯(lián)。而軟骨細胞II型膠原等產(chǎn)物的合成代謝可能受到其它調(diào)控因子的綜合影響，不能以CoREST調(diào)控“一元論”解釋。CoREST調(diào)控軟骨細胞終末分化的生物功能和分子通路仍有待深入研究。

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DifferentialexpressionanddistributionofCoRESTinosteoarthriticcartilage

XIAO Jun1, ZHAO Zan-dong1, SHI Zhan-jun1, LIANG Jin-qian2, WU Zhi-hong2, QIU Gui-xing2

(1DepartmentofOrthopaedics,NanfangHospital,Guangzhou510515,China;2DepartmentofOrthopaedicsandTraumatology,PekingUnionMedicalCollegeHospital,Beijing100730,China.E-mail:zhanjunshi@yahoo.com.cn)

AIM: To analyze the role of RE-1 silencing transcription factor corepressor (CoREST) in the pathogenesis of osteoarthritis (OA) by observing the differential expression and distribution ofCoRESTgene in the normal and osteoarthritic knee cartilages.METHODSThe samples of knee cartilage were obtained from the normal donors (n=10) and the patients undergoing total knee arthroplasty with the diagnosis of OA (n=12). The chondrocytes were isolated and paraffin sections were prepared. The expression levels ofCoRESTgene were determined in the normal and osteoarthritic chondrocytes by real-time PCR. The mRNA expression and distribution ofCoRESTin the individual layers, including the superficial, middle and deep layer of the normal and OA cartilage, were observed by the method ofinsituhybridization.RESULTSCompared with normal chondrocytes,CoRESTgene expression was down-regulated by 64.6% (P<0.01) in OA chondrocytes.CoRESTmRNA was generally expressed in all the superficial, middle and deep layers of the normal cartilage, in which the highest was in the middle layer and then in the deep and superficial layers. In OA cartilage, CoREST mRNA expression was up-regulated dominantly in the cell clusters of the superficial layer, whereas down-regulated in the cell columns of the deep layer.CONCLUSIONThe expression and distribution ofCoRESTgene between normal and OA chondrocytes are similar to those of the reported type X collagen. Based on the achievements of our previous study, we consider that the biological function of CoREST is correlated with the terminal differentiation of OA chondrocytes.

RE-1 silencing transcription factor corepressor; Osteoarthritis; Chondrocytes;Insituhybridization

R68

A

1000-4718(2011)03-0585-04

2010-08-16

2010-11-11

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院院長基金資助項目(No.2008C009)；廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(No.A2010362)

△通訊作者 Tel: 020-61641722; E-mail: zhanjunshi@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.032