張敬各， 陳海英， 秦 瑾，， 叢 斌△， 李巧霞， 賈嫻嫻， 馬春玲， 于 峰

(1 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊050017;2 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊050051)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞增生，以及軟骨和骨組織損害為特征的慢性自身免疫性疾病。其發(fā)病過(guò)程涉及多種因素，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是人體內(nèi)含量最多的一種前列腺素［1］，且是一種重要的炎癥介質(zhì)。目前廣泛用于治療RA 的非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti－inflammatory drugs，NSAID)正是通過(guò)抑制環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)從而抑制前列腺素(主要是PGE2)的產(chǎn)生而達(dá)到緩解癥狀的目的。PGE2通過(guò)與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體(E－prostanoid，EP)結(jié)合而發(fā)揮作用。已確定的EP 有4種亞型，即EP1、EP2、EP3 和EP4［2］，它們廣泛分布于機(jī)體各種組織和細(xì)胞中，通過(guò)與特定的G 蛋白偶聯(lián)而介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明，單獨(dú)敲除或抑制某一種EP 并不影響膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen－induced arthritis，CIA)小鼠的發(fā)病程度，而同時(shí)抑制EP2 和EP4 顯著降低CIA 關(guān)節(jié)炎評(píng)分，提示PGE2的關(guān)節(jié)炎效應(yīng)主要由EP2 和EP4 介導(dǎo)［3，4］。其它大量實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了兩者在RA 發(fā)病中的重要作用［5－8］。

目前認(rèn)為，B 細(xì)胞在RA 的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。Edwards 等［9］將治療B 細(xì)胞淋巴瘤的藥物rituximab(利妥昔單抗，一種清除B 細(xì)胞的抗體)用于RA 治療的成功，進(jìn)一步也證明了可以將B 細(xì)胞作為治療自身免疫病的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用CIA 小鼠模型，通過(guò)觀察EP2 和EP4 阻斷劑處理CIA 小鼠后，小鼠脾B 細(xì)胞表面分子和細(xì)胞因子表達(dá)的變化，探討PGE2及其受體EP2/EP4 在RA 發(fā)病機(jī)制中的作用，為指導(dǎo)臨床正確應(yīng)用NSAID，尋找更精確的抗炎藥物作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 不完全弗氏佐劑和雞Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ，col Ⅱ)購(gòu)自Sigma，EP2 阻斷劑AH6809 購(gòu)自Cayman，EP4 阻斷劑L161982 購(gòu)自Tocris，卡介苗購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，CD19+免疫磁珠購(gòu)自美天旎公司，Trizol 購(gòu)自Invitrogen，PrimeScriptTMRT reagent Kit 購(gòu)自大連寶生物公司，Power SYBR Green PCR Master Mix 購(gòu)自Applied Biosystems，流式抗體購(gòu)自eBioscience。

1.2 動(dòng)物 健康DBA/1 小鼠，6－8 周齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證書(shū)號(hào)為SCXK(滬)200720005。

2 方法

2.1 CIA 小鼠模型建立和分組 選用健康的DBA/1 小鼠36 只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(6 只)和CIA 單純?cè)炷＝M(12 只)，AH6809(EP2 阻斷劑)處理組(9只)，L161982(EP4 阻斷劑)處理組(9 只)。適應(yīng)環(huán)境3 d 后給小鼠尾根部皮內(nèi)注射雞Col Ⅱ200 μg及完全弗氏佐劑的乳化劑(其內(nèi)含有200 μg 結(jié)核分枝桿菌H37Ra)100 μL，第21 d 再次免疫增強(qiáng)。AH68095 和L161982 處理組分別給予相應(yīng)的藥物，劑量均為5 mg·kg－1·d－1，腹腔注射100 μL，從第2 次Col Ⅱ免疫后第2 d 開(kāi)始，連續(xù)14 d。

2.2 小鼠脾B 細(xì)胞制備 脫頸處死小鼠，無(wú)菌摘取脾臟，置于200 目不銹鋼篩網(wǎng)上，注射器針芯輕輕研磨，加入PBS 沖洗得到脾細(xì)胞懸液。取脾細(xì)胞用CD19+免疫磁珠分選B 細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度在95%以上。

2.3 B 細(xì)胞EPs 檢測(cè) 根據(jù)Trizol 說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 純度和濃度。取0.5 μg 總RNA 經(jīng)37 ℃15 min，85 ℃5 s 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，在ABI 7500 real－time PCR 儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件:95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。引物由上海生物技術(shù)工程公司合成。EP1 上游引物5’－ CCACTGGGGACGAGTACAGT－3’，下 游 引 物5’－ AGGTCAAGATGGGAACATGC－3’;EP2 上游引物5’－CTGGTAACGGAATTGGTGCT－3’，下 游 引 物5’－CAGGGAACAGAAGAGCAAGG－3’;EP3 上游引物5’－ CTCCAGCCTCAGAACCTTTG－3’，下游引物5’－GAAATGATGGCACGATTCCT－3’;EP4 上游引物5’－TCTCTGGTGGTGCTCATCTG－3’，下游引物5’－ACGTGCTGCTGATCTCCTTT’;β－actin 上游引物5’－TACCCAGGCATTGCTGACAGG－3’，下游引物5’－ACTTGCGGTGCACGATGGA－3’。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4 小鼠B 細(xì)胞CD80、CD86 和MHC Ⅱ表達(dá) 分選小鼠脾B 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×106cells/100 μL，分別加入FITC－抗CD80、FITC－抗CD86 或FITC－抗MHCⅡ抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS 洗滌2 次，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每次實(shí)驗(yàn)用同型抗體作對(duì)照，用平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)表示CD80、CD86 和MHCⅡ蛋白表達(dá)量。

2.5 小鼠B 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子mRNA 表達(dá) 取CIA小鼠脾B 細(xì)胞cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)。IFN－γ 上游引物5'－AGCAACAACATAAGCGTCAT－3'，下 游 引 物5'－CCTCAAACTTGGCAATACTC－3';TNF－α 上游引物5'－CTGTGAAGGGAATGGGTGTT－3'，下游引物5'－CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC－3';IL－10 上游引物5'－ACCAAAGCCACAAAGCAG－3'，下游引物5'－GGAGTCGGTTAGCAGTATG－3';IL－6 上游引物5'－TTCTTGGGACTGATGCTG－3'，下游引物5'－CTGGCTTTGTCTTTCTTGTT－3';IL－4 上 游 引 物5'－TC CTGCTCTTCTTTCTCG－3'，下游引物5'－TTCTCCTGTGACCTCGTT－3';TGF－β 上游引物:5'－ATGGTGGACCGCAACAAC－3'，下游引物5'－AGCCACTCAGGCGTATCAG－3'。以β－actin 為內(nèi)參照，序列同2.3。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 CIA 小鼠病變的形態(tài)學(xué)觀察及關(guān)節(jié)炎評(píng)分

小鼠于第1 次免疫后第27 d 足趾關(guān)節(jié)開(kāi)始出現(xiàn)腫脹，首先是兩后足出現(xiàn)紅腫，以后延伸到前足和尾部并日趨嚴(yán)重，第35 d 左右達(dá)到高峰，見(jiàn)圖1、2，提示CIA 小鼠模型建立成功。

Figure 1. Typical pattern of CIA in DBA/1 mice with the change of paw. A:normal paw;B:CIA paw.圖1 CIA 小鼠足爪

Figure 2. Typical pattern of CIA in DBA/1 mice with the change of arthritic scores.圖2 CIA 小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分

2 EPs 在B 細(xì)胞上的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR 技術(shù)檢測(cè)到PGE2受體的4 個(gè)亞型EP1、EP2、EP3、EP4 mRNA 在DBA 小鼠脾B 細(xì)胞上均有不同程度的表達(dá)。其中，EP2 表達(dá)最強(qiáng)，然后依次是EP1 和EP3，EP4 表達(dá)最弱，見(jiàn)圖3、4。

Figure 3. Gene expression of EP receptors in mouse B－cells.Total RNA was subjected to real－time PCR with primers specific for EP1，EP2，EP3 and EP4. Results are shown as an amplification plot for each EP receptor.圖3 熒光定量PCR 檢測(cè)的小鼠B 細(xì)胞上EPs 的熔解曲線

Figure 4. The mRNA expression of EPs in mouse B－cells detected by gel electrophoretogram. M:marker (100 bp ladder). The amplification products of EP1，EP2，EP3，EP4 and β－actin were approximately 329，303，319，343 and 218 bp，respectively.圖4 EPs 在正常小鼠B 細(xì)胞上的表達(dá)

3 CIA 模型中EP2/EP4 表達(dá)的變化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，CIA 模型小鼠脾B 細(xì)胞EP2/EP4 表達(dá)均明顯增多，分別增多了9.72和4.87 倍，見(jiàn)圖5。

Figure 5. The mRNA expression of EP2/EP4 in B－cells in normal group and CIA group analyzed by real－time PCR. ±s. ＊＊P ＜0.01 vs normal group.圖5 CIA 模型組小鼠B 細(xì)胞EP2/EP4 表達(dá)增加

4 小鼠脾B 細(xì)胞CD80、CD86 和MHCⅡ表達(dá)的變化

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，CIA 小鼠脾B 細(xì)胞CD80、CD86 和MHCⅡ表達(dá)均增加。與CIA 模型組相比，AH6809 處理組CD80、CD86 和MHCⅡ的表達(dá)均降低(P ＜0.05)，L161982 處理組CD86 和MHCⅡ的表達(dá)減少(P ＜0.05)。這表明EP2 阻斷劑能夠不同程度地抑制CD80、CD86 和MHCⅡ的表達(dá)，而EP4阻斷劑對(duì)CD86 和MHCⅡ的表達(dá)具有抑制作用，對(duì)CD80 的作用不明顯，見(jiàn)圖6。

Figure 6. FCM analysis of the expression of CD80，CD86 and MHC Ⅱin B－cells. ±s. #P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group;* P＜0.05 vs CIA group.圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠B 細(xì)胞CD80、CD86 和MHC Ⅱ表達(dá)的變化

5 小鼠脾B 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的變化

結(jié)果顯示，CIA 模型組小鼠IFN－γ 表達(dá)增加，IL－4 表達(dá)降低(P ＜0.05)，TNF－α 和IL－6 表達(dá)明顯增高(P ＜0.01)，TGF－β 和IL－10 的表達(dá)與正常組相比沒(méi)有明顯差異;EP2 阻斷劑AH6809 可以降低IFN－γ 的表達(dá)水平(P ＜0.05)，促進(jìn)IL－4 和IL－10 的表達(dá)(P ＜0.01)，抑制TNF－α 和IL－6 表達(dá)的增加(P ＜0.01);EP4 阻斷劑L161982 可以抑制IFN－γ、TNF－α 和IL－6 表達(dá)的增加(P ＜0.05 和P ＜0.01)，提高TGF－β 和IL－10 的表達(dá)水平(P ＜0.01 和P ＜0.05)，見(jiàn)圖7。

Figure 7. The expression of cytokines in B cells analyzed by real－time PCR. ± s. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CIA group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group.圖7 不同處理組B 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)變化

討 論

大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗CD20 單克隆抗體(rituximab)通過(guò)選擇性去除B 細(xì)胞，對(duì)難治性RA 患者具有很好的治療作用，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)許多治療患者血清自身抗體并未減低，使人們逐漸意識(shí)到B 細(xì)胞促進(jìn)疾病發(fā)生可能并不完全依賴(lài)抗體形成，而其抗原提呈、細(xì)胞因子生成及激活T 細(xì)胞的功能在許多炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用［10］。

PGE2作為重要的介質(zhì)之一，在RA 發(fā)病過(guò)程中起著重要的病理生理作用。PGE2與受體結(jié)合是PGE2發(fā)揮作用的前提，因此，我們首先檢測(cè)了小鼠B細(xì)胞上EPs 的表達(dá)情況，EPs 在B 細(xì)胞上的存在及在CIA 模型中EP2/EP4 表達(dá)的增加均為PGE2通過(guò)B 細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用提供了直接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也為其受體阻斷劑可以通過(guò)與B 細(xì)胞作用影響免疫調(diào)節(jié)功能提供了理論依據(jù)。

在免疫應(yīng)答過(guò)程中，T 細(xì)胞的激活需雙信號(hào)的刺激，第一信號(hào)為抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)表面MHC－Ag 復(fù)合物分子與T 細(xì)胞特異性受體結(jié)合，第二信號(hào)為APC 表面共刺激分子與T細(xì)胞相應(yīng)的配體結(jié)合。兩種信號(hào)協(xié)調(diào)刺激作用后才可激活T 細(xì)胞，參與免疫殺傷效應(yīng)以及細(xì)胞免疫過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了B 細(xì)胞表面抗原提呈相關(guān)分子MHCⅡ和共刺激分子CD80/CD86 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，CIA 模型小鼠脾B 細(xì)胞MHCⅡ和CD80/CD86表達(dá)均明顯增多，說(shuō)明B 細(xì)胞的抗原提呈功能明顯增強(qiáng)。EP2/EP4 阻斷劑通過(guò)不同程度地抑制CIA 小鼠B 細(xì)胞MHCⅡ和CD80/CD86 的表達(dá)可以抑制B細(xì)胞與活化T 細(xì)胞的反應(yīng)，從而可能達(dá)到改善RA 癥狀的目的。

細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞因子失衡在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用，在RA 的病程中，細(xì)胞因子對(duì)炎癥的調(diào)控具有重要地位［11］。IFN－γ 有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，能活化NK 細(xì)胞，提高其殺傷能力;誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和B 細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子，提高其抗原提呈能力。而IL－4 能抑制IFN－γ 的分泌，維持Th2 的增殖，拮抗IFN－γ 的前炎癥效應(yīng)并抑制Th1細(xì)胞的增生［12］，對(duì)軟骨和骨的破壞具有保護(hù)作用。TNF－α 可上調(diào)單核巨噬細(xì)胞MMP－9 表達(dá)及活化，增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的侵蝕力，可能在RA 關(guān)節(jié)破壞機(jī)制中起著重要的作用［13］;抑制TNF－α 可以阻止RA 的發(fā)生，用阻斷TNF－α 活性的藥物可以改善RA 臨床癥狀［14］。IL－6 是B 細(xì)胞分化因子，與RA 患者的骨和軟骨破壞及骨質(zhì)疏松有關(guān)。干預(yù)IL－6 活性也是一種RA 治療途徑［15］。B 細(xì)胞分泌的IL－10 既可以通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡抑制免疫病理反應(yīng)，又可以直接消弱免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［16］。臨床上已經(jīng)將IL－10 作為一種生物制劑用于RA 的治療。而TGF－β 既可以誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞分化，下調(diào)免疫應(yīng)答，又可以抑制Th1 細(xì)胞功能，促進(jìn)Th17 分化［17］。

研究表明，PGE2可通過(guò)EP2/EP4 信號(hào)和cAMP途徑抑制CD4+T 細(xì)胞IL－10 生成［5］，促進(jìn)IFN－γ和IL－17 生成促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)［5，6］;又可抑制巨噬細(xì)胞TNF－α 表達(dá)，促進(jìn)IL－6 生成發(fā)揮抗炎作用［7］。PGE2究竟發(fā)揮促炎作用還是抗炎作用依賴(lài)于不同的疾病和模型、不同的受體亞型、不同的細(xì)胞及其不同的微環(huán)境等而異。本實(shí)驗(yàn)中，CIA 模型組小鼠B 細(xì)胞IFN－γ 表達(dá)增加，IL－4 表達(dá)降低，TNF－α 和IL－6 表達(dá)明顯增高。EP2 阻斷劑可以降低IFN－γ、TNF－α 和IL－6 的表達(dá)水平，而促進(jìn)IL－4和IL－10 的表達(dá);EP4 阻斷劑可以抑制IFN－γ、TNF－α 和IL－6 的表達(dá)水平，而促進(jìn)TGF－β 和IL－10的表達(dá)。表明PGE2受體EP2 和EP4 介導(dǎo)了CIA 小鼠B 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的生成，發(fā)揮了促炎作用，推測(cè)PGE2通過(guò)調(diào)節(jié)EP2/EP4 受體途徑有可能改善關(guān)節(jié)炎的癥狀。

［1］ 劉美玲，張一娜，裴立春，等.前列腺素E 受體1 在缺氧性神經(jīng)細(xì)胞死亡中的作用［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2010，26(5):885－888.

［2］ Tsuboi K，Sugimoto Y，Ichikawa A. Prostanoid receptor subtypes［J］. Prostaglandins Other Lipid Mediat，2002，68－69:535－556.

［3］ McCoy JM，Wicks JR，Audoly LP. The role of prostaglandin E2 receptors in the pathogenesis of rheumatoid arthritis［J］. J Clin Invest，2002，110(5):651－658.

［4］ Honda T，Segi－Nishida E，Miyachi Y，et al. Prostacyclin－IP signaling and prostaglandin E2－EP2/EP4 signaling both mediate joint inflammation in mouse collagen－induced arthritis［J］. J Exp Med，2006，203(2):325－335.

［5］ Boniface K，Bak－Jensen KS，Li Y，et al. Prostaglandin E2 regulates Th17 cell differentiation and function through cyclic AMP and EP2/EP4 receptor signaling［J］. J Exp Med，2009，206(3):535－548.

［6］ Yao C，Sakata D，Esaki Y，et al. Prostaglandin E2－EP4 signaling promotes immune inflammation through TH1 cell differentiation and TH17 cell expansion［J］. Nat Med，2009，15(6):633－640.

［7］ Akaogi J，Yamada H，Kuroda Y，et al. Prostaglandin E2receptors EP2 and EP4 are up－regulated in peritoneal macrophages and joints of pristane－treated mice and modulate TNF－α and IL－6 production［J］. J Leukoc Biol，2004，76(1):227－236.

［8］ Chen BC，Liao CC，Hsu MJ，et al. Peptidoglycan－induced IL－6 production in RAW 264.7 macrophages is mediated by cyclooxygenase－2，PGE2/PGE4receptors，protein kinase A，IκB kinase，and NF－κB［J］. J Immunol，2006，177(1):681－693.

［9］ Edwards JC，Szczepanski L，Szechinski J，et al. Efficacy of B－cell－targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis［J］. N Engl J Med，2004，350(25):2572－2581.

［10］ Lund FE. Cytokine－producing B lymphocytes－key regulators of immunity［J］. Curr Opin Immunol，2008，20(3):332－338.

［11］ Cao Y，Doodes PD，Glant TT，et al. IL－27 induces a Th1 immune response and susceptibility to experimental arthritis［J］. J Immunol，2008，180(2):922－930.

［12］ Skapenko A，Leipe J，Lipsky PE，et al. The role of the T cell in autoimmune inflammation［J］. Arthritis Res Ther，2005，7(Suppl 2):S4－S14.

［13］ 謝建民，王好問(wèn)，陸才生. TNF－α 上調(diào)單核巨噬細(xì)胞MMP－9 的活性與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)破壞的關(guān)系［J］.中國(guó)病理生理雜志，2009，25(6):1181－1185.

［14］ Llanos C，Soto L，Sabugo F，et al. The influence of－238 and－308 TNF α polymorphisms on the pathogenesis and response to treatment in rheumatoid arthritis［J］. Rev Med Chil，2005，133(9):1089－1095.

［15］ Nishimoto N. Cytokine signal regulation and autoimmune disorders［J］. Autoimmunity，2005，38(5):359－367.

［16］ Fillatreau S，Sweenie CH，Mcgeachy MJ，et al. B cells regulate autoimmunity by provision of IL－10［J］. Nat Immunol，2002，3(10):944－950.

［17］ Santarlasci V，Maggi L，Capone M，et al. TGF－β indirectly favors the development of human Th17 cells by inhibiting Th1 cells［J］. Eur J Immunol，2009，39(1):207－215.