原玉芬， 王杜娟， 潘運(yùn)寶， 梁 廣， 肖 健， 王蘇美， 楊惠玲△

(1 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州510080;2 溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江 溫州325085)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)以“廣東癌”著稱，放療仍是鼻咽癌的首選療法。盡管放療技術(shù)幾經(jīng)改良或與化療聯(lián)用，但由于輻射抗拒所致的放療后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，嚴(yán)重制約了NPC患者5 年生存率的提高，因此尋找逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的藥物是關(guān)鍵。姜黃素(curcumin)是一種人工提取的天然化合物，其具有廣譜抗癌作用［1，2］，同時(shí)也有研究表明姜黃素可抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，特別是其可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞G2/M 期停滯［3，4］，推測(cè)其有助放療增敏。但其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定且代謝速度快，大大限制其臨床運(yùn)用;我們采用單羰基基團(tuán)替換姜黃素結(jié)構(gòu)中不穩(wěn)定的β－二酮基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成多種單羰基姜黃素類(lèi)似物;初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素類(lèi)似物可不同程度抑制多種腫瘤細(xì)胞［5，6］，而姜黃素類(lèi)似物B67 對(duì)鼻咽癌特別是鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞作用及其機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)觀測(cè)B67 對(duì)不同輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞CNE－2R 與CNE－2 作用的差異，以闡明B67 對(duì)輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞CNE－2R 的特異性及其逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)輻射抗拒藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

RPMI－1640 培養(yǎng)基為Gibco 產(chǎn)品。四甲基偶氮唑鹽［3－(4，5－dimethylthiazo－2－yl)－2，5－diphenyl－tetrazolium bromide，MTT］、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)和羅丹明123(Rhodamine 123，Rh123)為Sigma 產(chǎn)品。單羰基姜黃素類(lèi)似物B67 和姜黃素粉劑由溫州醫(yī)學(xué)院合成或提供。小牛血清購(gòu)自PAA 公司。膜聯(lián)蛋白(Annexin－V)－異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物科技發(fā)展有限公司。低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE－2 購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株CNE－2R 為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。Sunrise 全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Tecan。IX71倒置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus。流式細(xì)胞儀(BD)。BALB/c 裸鼠，5 周齡，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 MTT 法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響 用胰蛋白酶(2.5 g/L)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間(24 h、48 h、72 h)調(diào)整細(xì)胞懸液濃度分別為1 ×108cells/L、6 ×107cells/L、4 ×107cells/L 并加入96 孔板中，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，培養(yǎng)24 h，于各實(shí)驗(yàn)組再加相應(yīng)濃度藥物，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白組再加入培養(yǎng)基，以上總液體均為每孔200 μL，每組設(shè)6 個(gè)孔，重復(fù)3 次。分別孵育24、48、72 h，此后加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，繼續(xù)在5% CO2、37 ℃下孵育4 h。輕輕甩出板內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，此后96 孔板避光置搖床上低速振蕩10 min 并用排槍輕輕吹打均勻，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)量各孔的吸光度(A)值。按以下公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞活性抑制率:

2.2 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1 ×105cells/L，每孔滴加2 mL，懸液接種于6 孔板，24 h 后吸去孔內(nèi)殘余培養(yǎng)基，并在相應(yīng)組加入不同濃度藥液或培養(yǎng)液。藥物作用48 h 時(shí)棄上清，加全培養(yǎng)基2 mL/well 繼續(xù)培養(yǎng)7 d。棄上清，甲醇固定和姬姆薩染色后顯微鏡下計(jì)算集落數(shù)，以≥50 個(gè)細(xì)胞作1 個(gè)集落，按下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率:

2.3 Hoechst 染色法觀察凋亡形態(tài)學(xué)變化 調(diào)整B67 作用終濃度為5 μmol/L，對(duì)細(xì)胞作用48 h 時(shí)甲醇固定后Hoechst 33342 染色，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡率 調(diào)整B67 作用終濃度為5 μmol/L，對(duì)細(xì)胞作用48 h 時(shí)無(wú)EDTA 酶消化收集細(xì)胞，各待檢標(biāo)本保證細(xì)胞總數(shù)不少于106個(gè)，離心棄上清以PBS 洗2 遍，并用Annexin－V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)(Annexin V/PI)雙染色標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。

2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期分布 調(diào)整B67 作用終濃度為5 μmol/L，對(duì)細(xì)胞作用24 h 時(shí)胰酶消化收集細(xì)胞，各待檢標(biāo)本保證細(xì)胞總數(shù)不少于106個(gè)離心棄上清以75%乙醇固定4 ℃過(guò)夜，第2 d 離心棄上清，PBS 洗2 遍，加入終濃度為50 mg/L RNAase 及50 mg/L PI，終體積為500 μL;以流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 流式細(xì)胞儀測(cè)線粒體膜電位 調(diào)整B67 作用終濃度為5 μmol/L，對(duì)細(xì)胞作用48 h 時(shí)胰酶消化收集細(xì)胞，各待檢標(biāo)本保證細(xì)胞總數(shù)不少于106個(gè)離心棄上清以PBS 洗2 遍，將細(xì)胞重懸于100 μg/L Rh123 的2 mL 染液中，37 ℃避光染色30 min，結(jié)束后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。

2.7 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 調(diào)整B67 作用終濃度為5 μmol/L，對(duì)細(xì)胞作用48 h 時(shí)胰酶消化收集細(xì)胞，各待檢標(biāo)本保證細(xì)胞總數(shù)不少于106個(gè)，離心棄上清，以PBS 洗2 遍，用PBS 調(diào)整對(duì)照組細(xì)胞濃度為7.5 ×109cells/L，其余組細(xì)胞以等體積PBS 制備細(xì)胞懸液。在每只裸鼠背部的左上和右下分別注射0.2 mL 細(xì)胞懸液，每組3 只裸鼠，觀察裸鼠皮下成瘤情況。成瘤后定期測(cè)量腫瘤的三維空間尺度，根據(jù)公式:V(mm3)=Length×Width2/2 分別計(jì)算出各組每個(gè)腫瘤的近似體積。當(dāng)裸鼠皮下腫瘤的體積約1 000 mm3(接種CNE－2 及CNE－2R 后分別生長(zhǎng)17 d 和26 d)時(shí)處死，取出腫瘤進(jìn)行檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sE)表示，連續(xù)型數(shù)據(jù)的組間比較采用方差分析(One－way ANOVE)，離散型數(shù)據(jù)的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 B67 對(duì)NPC 細(xì)胞活性影響的比較

B67 作用24、48、72 h 后，NPC 細(xì)胞活性的抑制率見(jiàn)表1。采用IC50軟件統(tǒng)計(jì)得到B67 作用于NPC細(xì)胞24、48、72 h 后，其IC50分別為(3.96 ±0.14)、(2.59 ±0.15)和(0.89 ±0.08)μmol/L(CNE－2R)及(8.84 ±0.57)、(3.55 ±0.04)和(1.10 ±0.01)μmol/L(CNE－2)。

表1 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞活性的影響Table 1. Comparison of the viability of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(±sE.n=3)

表1 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞活性的影響Table 1. Comparison of the viability of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(±sE.n=3)

B67(μmol/L)24 h inhibition ratio(%)48 h inhibition ratio(%)72 h inhibition ratio(%)CNE－2R CNE－2 CNE－2R CNE－2 B67(μmol/L) CNE－2R B67(μmol/L) CNE－2 0 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0 0.00±0.00 0 0.00±0.00 1 5.15±0.93 5.70±2.38 9.88±2.72 10.36±0.69 0.1 6.06±1.22 0.1 5.23±1.88 2 16.65±2.54 10.76±3.52 55.10±1.45 14.74±1.64 0.2 8.28±1.75 0.25 8.35±1.50 4 77.61±0.60 42.51±5.62 83.54±0.39 83.37±0.55 0.4 9.61±2.42 0.5 10.79±2.11 8 84.98±1.58 51.01±1.80 85.74±0.20 84.13±0.60 0.8 15.19±1.29 1 18.79±0.42 12 85.56±1.52 57.68±2.45 85.91±0.17 84.33±0.79 1.5 66.85±2.43 1.5 66.91±4.43 16 87.46±0.30 59.28±2.73 87.85±0.45 86.41±0.79 2 95.50±0.82 2 90.45±1.67

2 B67 對(duì)NPC 細(xì)胞增殖影響的比較

B67 作用48 h 后，NPC 細(xì)胞增殖的抑制率見(jiàn)表2。采用IC50軟件統(tǒng)計(jì)得到B67 作用于NPC 細(xì)胞48 h 后，其IC50分別為(0.55 ±0.00)μmol/L(CNE－2R)和(0.73±0.03)μmol/L(CNE－2)。

表2 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞增殖的影響Table 2. Comparison of the proliferation of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(±sE.n=3)

表2 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞增殖的影響Table 2. Comparison of the proliferation of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(±sE.n=3)

# P ＜0.05 vs curcumin 1μmol/L group.

B67(μmol/L)Inhibition ratio(%)CNE－2R CNE－2 Curcumin(μmol/L)Inhibition ratio(%)CNE－2R CNE－2 0 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.1 17.48 ±1.44# 12.33 ±0.68# 1 13.86 ±1.08 7.15 ±1.76 0.25 26.14 ±0.92 18.40 ±1.46 2.5 18.80 ±2.51 15.21 ±1.23 0.5 37.87 ±1.78 30.26 ±3.09 5 29.98 ±1.85 24.31 ±2.35 1.0 72.92 ±0.65 67.86 ±3.09 10 40.39 ±0.50 34.15 ±2.13 1.5 98.79 ±1.21 96.05 ±0.82 15 79.37 ±2.05 77.3 2 ±3.84

3 B67 對(duì)NPC 細(xì)胞凋亡形態(tài)影響的比較

Hoechst 33342 染色結(jié)果見(jiàn)圖1，B67 作用48 h后可引起NPC 細(xì)胞凋亡，主要是細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為細(xì)胞核數(shù)量顯著下降，大量鼻咽癌細(xì)胞胞核體積明顯減小，有些細(xì)胞核形狀不規(guī)則，其中一些有染色質(zhì)濃縮、邊緣化和核固縮現(xiàn)象等。而空白對(duì)照組細(xì)胞核光滑，形態(tài)較均勻一致，未見(jiàn)核固縮或者核碎裂。同時(shí)采用姜黃素處理2 種細(xì)胞后所引起的形態(tài)改變與空白對(duì)照組相比，除了少量細(xì)胞核體積稍小外，無(wú)其它明顯變化。上述結(jié)果提示B67 可使CNE－2R 和CNE－2 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)改變。

Figure 1. Comparison of the morphology of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(Hoechst 33342 staining，×100).圖1 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞形態(tài)的影響

4 B67 對(duì)NPC 細(xì)胞周期影響的比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，與CNE－2 相比，5 μmol/L B67 作用48 h 時(shí)較特異地誘導(dǎo)CNE－2R細(xì)胞G2/M 期阻滯。

表3 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞周期影響的比較Table 3. Comparison of the cell cycle of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(5 μmol/L)or curcumin(5 μmol/L)(±sE.n=3)

表3 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞周期影響的比較Table 3. Comparison of the cell cycle of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(5 μmol/L)or curcumin(5 μmol/L)(±sE.n=3)

* P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs curcumin group;△P ＜0.05 vs CNE－2 group.

Group G0/G1(%)S(%)G2/M(%)CNE－2R CNE－2 CNE－2R CNE－2 CNE－2R CNE－2 Control 42.66 ±1.54△ 53.47 ±0.52 52.02 ±1.44△37.47 ±0.59 5.32 ±0.50 9.07 ±0.55 Curcumin 39.10 ±6.70△ 51.33 ±0.33 49.54 ±6.72 39.50 ±0.46 11.35 ±0.02 9.17 ±0.72 B67 24.90 ±0.73＊△ 57.57 ±0.97* # 35.09 ±3.53* # 26.71 ±0.95* # 40.01 ±4.25＊△ 15.73 ±1.04*#

5 B67 對(duì)NPC 細(xì)胞凋亡影響的比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，5 μmol/L B67 作用48 h 可誘導(dǎo)CNE－2R 和CNE－2 細(xì)胞凋亡，但2種細(xì)胞間差異不顯著;同等條件下姜黃素則未能誘導(dǎo)2 種細(xì)胞的凋亡。

表4 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞凋亡影響的比較Table 4. Comparison of the apoptosis of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(5 μmol/L)or curcumin(5 μmol/L)(±sE.n=3)

表4 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞凋亡影響的比較Table 4. Comparison of the apoptosis of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(5 μmol/L)or curcumin(5 μmol/L)(±sE.n=3)

* P ＜0.05 vs control group;# P ＜0.05 vs curcumin group.

Group Viable(%)Apoptosis(%)CNE－2R CNE－2 CNE－2R CNE－2 Control 92.06±0.40 90.92±1.18 5.49±1.00 4.9 9±0.46 Curcumin 88.53±1.35 91.63±1.02 5.95±0.64 4.76±0.53 B67 52.94±3.96* # 45.53±1.46* # 38.06±1.25* # 35.74±1.39*#

6 B67 對(duì)NPC 細(xì)胞線粒體膜電位影響的比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5，5 μmol/L B67 作用48 h 可使CNE－2R 和CNE－2 細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，其下降率分別為66.76%和72.09%，P＜0.05，2 種細(xì)胞間差異不顯著;其作用明顯優(yōu)于等濃度姜黃素。

表5 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞線粒體膜電位影響的比較Table 5. Comparison of the change of mitochondrial membrane potential of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(5 μmol/L)or curcumin(5 μmol/L)(±sE.n=3)

表5 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞線粒體膜電位影響的比較Table 5. Comparison of the change of mitochondrial membrane potential of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67(5 μmol/L)or curcumin(5 μmol/L)(±sE.n=3)

* P ＜0.05 vs control group;# P ＜0.05 vs curcumin group;△P ＜0.05 vs CNE－2 group.

Group CNE－2R CNE－2 Control 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 Curcumin 16.08 ±1.22＊△ 31.50 ±1.90*B67 66.76 ±10.88* # 72.09 ±1.20*#

7 姜黃素類(lèi)似物B67 作用于NPC 細(xì)胞后成瘤性的比較

在接種細(xì)胞17 d 后，空白對(duì)照組和10 μmol/L姜黃素組均長(zhǎng)出腫瘤;5 μmol/L B67 作用于CNE－2組亦長(zhǎng)出腫瘤，但CNE－2R 組未長(zhǎng)出腫瘤;而10 μmol/L B67 組均未長(zhǎng)出腫瘤，見(jiàn)表6。未成瘤組繼續(xù)觀察9 d 后仍未出現(xiàn)腫瘤。這提示B67 作用明顯優(yōu)于等濃度姜黃素，且對(duì)CNE－2R 作用更強(qiáng)。

表6 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞成瘤性作用的比較Table 6. Comparison of tumor volume of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67 or curcumin (±sE.n=3)

表6 B67 對(duì)CNE－2 和CNE－2R 細(xì)胞成瘤性作用的比較Table 6. Comparison of tumor volume of CNE－ 2 and CNE－2R cell lines after treatment with B67 or curcumin (±sE.n=3)

* P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs Cur group;△P ＜0.05 vs CNE－2 group Cur:curcumin.

Group CNE－2R CNE－2 Control 569.19 ±96.76△1 212.45 ±137.06 Cur(10 μmol/L) 254.27 ±113.11＊△ 896.08 ±112.91*B67(5 μmol/L) 0 ±0* #△ 776.01 ±130.03*B67(10 μmol/L) 0 ±0* # 0 ±0*#

討 論

鼻咽癌細(xì)胞系CNE－2R 細(xì)胞是本室對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系CNE－2 采用爬坡式間歇性大劑量X 線誘導(dǎo)構(gòu)建的，與CNE－2 細(xì)胞比，CNE－2R 細(xì)胞G2期細(xì)胞減少且出現(xiàn)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的異常改變［7］。CNE－2R 和CNE－2 是具有同來(lái)源不同輻射抗拒的鼻咽癌細(xì)胞，且因其與臨床長(zhǎng)期放療后的殘存細(xì)胞具有相似性，故為尋找逆轉(zhuǎn)輻射藥物的理想細(xì)胞模型［8］。同時(shí)，我們的前期研究表明，鼻咽癌細(xì)胞的輻射抗拒與其差異表達(dá)的miRNA 密切相關(guān)［9］。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B67 可較特異地抑制鼻咽癌輻射抗拒CNE－2R 細(xì)胞的活性和增殖。同時(shí)通過(guò)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B67 不僅能誘導(dǎo)鼻咽癌輻射敏感細(xì)胞CNE－2 凋亡，且對(duì)鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞CNE－2R 具有相同的效應(yīng)，推測(cè)輻射抗拒并不促進(jìn)B67 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)。

值得一提的是通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與CNE－2 細(xì)胞比，B67 可更特異地誘導(dǎo)CNE－2R細(xì)胞G2/M 期的阻滯，同時(shí)G1期細(xì)胞減少。一般認(rèn)為G2/M 期對(duì)輻射或化療最敏感，G1期最不敏感［10］，這些提示B67 主要通過(guò)影響細(xì)胞周期百分率的分布，而具有逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞輻射抗拒的作用。已有研究表明Wingless/Wnt 及STAT3 信號(hào)通路與細(xì)胞黏附通路參與了姜黃素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)［1，11］。盡管B67 仍具有其前體姜黃素的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，但具體通路可能與姜黃素存在差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B67 可引起線粒體膜電位降低，由此推測(cè)其誘導(dǎo)鼻咽癌凋亡的具體通路，可能與線粒體凋亡通路有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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