高 健, 丁建南, 康 健, 吳學(xué)玲, 邱冠周

(1. 湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湘潭 411201；2. 中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083)

分離于酸性礦坑水的疑似鉤端螺旋菌的鑒定及重金屬對其鐵氧化能力影響的評估

高 健1, 丁建南2, 康 健1, 吳學(xué)玲2, 邱冠周2

(1. 湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湘潭 411201；2. 中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083)

采用稀釋分離法，從山西中條山銅礦的酸性礦坑水中分離出一株鐵氧化細(xì)菌，命名為ZTS菌株。該菌株為革蘭氏陰性細(xì)菌，螺旋狀或弧狀，最適生長溫度為30 ℃，最適生長pH值為2.5，對低濃度的酵母浸出物較敏感。形態(tài)學(xué)和生理學(xué)分析表明，ZTS菌株可能屬于鉤端螺旋菌屬的成員；16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該菌株與氧化亞鐵鉤端螺旋菌典型菌株ATCC 49879位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，相似度為100%，從而證實(shí)ZTS菌株屬于氧化亞鐵鉤端螺旋菌?？紤]到當(dāng)前的商業(yè)利益，考察了Cu2+、Co2+和Ni2+對ZTS菌株氧化亞鐵能力的影響。結(jié)果表明：3種金屬對ZTS菌株的毒性強(qiáng)弱依次為Co2+＞Cu2+＞Ni2+。就Ni2+抗性能力而言，ZTS菌株能夠耐受Ni2+的濃度高達(dá)160 mmol/L，這比已報(bào)道的氧化亞鐵鉤端螺旋菌的Ni2+抗性能力要強(qiáng)得多，這種能力可能與它的遺傳特性有關(guān)。

酸性礦坑水；氧化亞鐵鉤端螺旋菌；鐵氧化能力；重金屬抗性

嗜酸細(xì)菌，如硫桿菌屬的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌和嗜酸氧化硫硫桿菌[1]以及鉤端螺旋菌屬的氧化亞鐵鉤端螺旋菌等，在低品位硫化礦的生物浸出過程中扮演了極為重要的角色[2?3]。在這個(gè)浸出過程中，亞鐵離子的生物氧化被證明是非常關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)[4]。然而，在浸礦細(xì)菌的亞鐵離子氧化能力與它們能夠耐受浸礦體系中可溶性金屬離子濃度的水平之間存在某種必然的聯(lián)系。隨著硫化礦的生物浸出過程的進(jìn)行，諸如銅、鋅和鎳等金屬離子不斷積累到浸礦溶液中，當(dāng)它們超過一定的濃度時(shí)，必然會(huì)對浸礦細(xì)菌產(chǎn)生毒性，從而影響浸出速率[5]。因此，深入了解浸礦細(xì)菌對各種從硫化礦中釋放的金屬離子的抗性能力十分必要。

以前的研究主要集中在嗜酸氧化亞鐵硫桿菌[5?10]、嗜酸氧化硫硫桿菌[11?13]、布氏酸菌[14]、嗜酸熱硫化葉菌[15]和喜溫硫桿菌[16]等浸礦細(xì)菌或古生菌的亞鐵氧化能力或金屬抗性方面。但對鉤端螺旋屬的成員的亞鐵氧化能力或金屬抗性方面的研究只有較少的一些報(bào)道[2,17?18]，其原因主要在于鉤端螺旋菌分離純化的困難。已有的研究證實(shí)，在溫度高于40 ℃、pH小于1.4時(shí)，鉤端螺旋菌在工業(yè)連續(xù)流生物反應(yīng)槽中屬于主要的鐵氧化細(xì)菌。因此，在過去的幾年里，我們團(tuán)隊(duì)主要圍繞鉤端螺旋菌，尤其是嗜鐵鉤端螺旋菌的分離純化做了大量的工作，并建立了一種高效的選擇性分離方法[19]。目前，我們在以前的工作基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)原有的方法，開展對鉤端螺旋菌屬的另一個(gè)種，即氧化亞鐵鉤端螺旋菌的分離工作。最近采用改良的方法從山西省中條山銅礦酸性礦坑水中分離出一株疑似鉤端螺旋菌的菌株，將其命名為ZTS菌株。為確切了解該菌株的分類地位以及對重金屬離子耐受能力，本文作者在本研究中有兩個(gè)目的：一是從形態(tài)、生理和分子水平對疑似為鉤端螺旋菌的ZTS菌株進(jìn)行鑒定；二是基于商業(yè)利益，考察銅、鈷和鎳3種金屬離子對ZTS菌株亞鐵氧化能力的影響，以期為進(jìn)一步的基礎(chǔ)應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種來源

菌株分離于山西中條山銅礦的礦坑水，取樣時(shí)礦坑水溫度為16 ℃，pH為2.0。液體樣品的元素分析采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)，液體樣品主要的元素濃度見表1。

表1 AMD樣品中主要的元素Table 1 Main elements in AMD sample(mg/L)

1.2 菌種的富集分離

1.2.1 培養(yǎng)基

1) 9 K培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2SO4, 3.00；KCl, 0.10；K2HPO4, 0.50；MgSO4·7H2O，0.50；Ca (NO3)2, 0.01；FeSO4·7H2O, 44.2。用5 mol/L的硫酸調(diào)節(jié)pH到2.5即可。

2) 改良的9 K培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2SO4, 3.00； KCl, 0.10； K2HPO4, 0.30；MgSO4·7H2O，0.40；FeSO4·7H2O, 56.0；Fe2(SO4)3·XH2O(終濃度為10 mmol/L)，Al2(SO4)3·18H2O(終濃度為1 mmol/L)，用5 mol/L的硫酸調(diào)節(jié)pH到1.6即可。

1.2.2分離純化

將樣品接種到已經(jīng)濕熱滅菌的盛有液體9 K培養(yǎng)基的三角瓶中(培養(yǎng)基的pH為2.5、Fe2+濃度為20～30 g/L)，將其置于30 ℃空氣浴搖床中振蕩，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時(shí)，即獲得第一代富集培養(yǎng)物。鏡檢、觀察到螺旋狀細(xì)菌后，將適量第一代富集培養(yǎng)物按照上述方法接種，除了培養(yǎng)基中的Fe2+濃度改變?yōu)?0～60 g/L外，其他培養(yǎng)條件不變，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時(shí)，即獲得第二代富集培養(yǎng)物。鏡檢、觀察到螺旋狀細(xì)菌后，將適量第二代富集培養(yǎng)物仍然按照上述方法接種，除了pH為1.6、溫度為37℃和加入終濃度為10 mmol/L的Fe3+外，其他培養(yǎng)條件與獲得第二代富集物的條件相同，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時(shí)，即獲得第三代富集培養(yǎng)物。鏡檢、觀察到螺旋狀細(xì)菌后，將適量第三代富集培養(yǎng)物仍然按照上述方法接種，除了加入1 mmol/L的Al3+外，其他培養(yǎng)條件與獲得第三代富集物的條件相同，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時(shí)，即獲得第四代富集培養(yǎng)物。將第四步重復(fù)3次，然后，將最終的富集培養(yǎng)物采用稀釋分離法進(jìn)行純化。稀釋純化時(shí)，富集物分別按10?1、10?2、10?3、10?4、10?5、10?6、10?7、10?8和10?9稀釋度接種到未改良的液體9 K培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即未加Fe3+和Al3+，其他基本培養(yǎng)條件不變，最高稀釋度條件下獲得的培養(yǎng)物被命名為ZTS菌株。

1.3 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

離心收集培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體，用pH為1.5的稀硫酸洗滌幾次以去除Fe3+，再用滅菌蒸餾水洗滌幾次。一方面取適量菌體進(jìn)行革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，另一方面取適量菌體用4%的戊二醛固定處理后在透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)。

1.4 菌株最適生長溫度和最適生長pH的測定

將離心收集的菌體洗滌后，重新懸浮在不含F(xiàn)e2+的9K基本培養(yǎng)基中(濃度約為1×109個(gè)細(xì)胞/mL)作為種子待用。在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/mim、接種量為5%( v/v)的條件下，采用重鉻酸鉀滴定法[20]測定菌株在不同溫度、不同pH條件下的氧化Fe2+能力。按照文獻(xiàn)[4]描述的方法，定時(shí)測定Fe2+的濃度和用無菌蒸餾水補(bǔ)充因蒸發(fā)損失的水分。試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)平行樣，所得結(jié)果為兩者的平均值。

1.5 酵母提取物對ZTS菌株氧化亞鐵影響的評估

基于上述測定的最適生長溫度和pH，在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/mim、接種量為5%(v/v)的條件下，采用重鉻酸鉀滴定法測定不同濃度的酵母提取物對ZTS菌株的Fe2+氧化能力。定時(shí)測定Fe2+的濃度和用無菌蒸餾水補(bǔ)充因蒸發(fā)損失的水分。試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)平行樣，所得結(jié)果為兩者的平均值。

1.6 菌株基因組DNA的提取和16S rDNA PCR擴(kuò)增、克隆與測序

離心收集適量菌體, 用pH為1.5的硫酸溶液洗滌3次后，采用上海生工公司生產(chǎn)的UNIQ-10 柱式基因組DNA 抽提試劑盒提取基因組DNA。

16S rRNA 基因的PCR擴(kuò)增采用通用引物對[21]：27f(5′- CAGAGTTTGATCGTGGCTCAG -3′) 和1506f (5′-CGGGTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×PCR緩沖液，5.0 μL；Mg2+(25 mmol/L), 3.0 μl；dNTP(各5 mmol/L)，2.0 μL；引物(20 μmol/L)各1.0 μL；Taq DNA聚合酶(1 U/μL，MBI)，l.0 μL；模板2.0 μL約20 ng；去離子水35 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，然后，94 ℃, 30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，1.0 min；30個(gè)循環(huán)后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用Omega公司生產(chǎn)的E.Z.N.ATM凝膠回收試劑盒純化；純化的PCR產(chǎn)物用Invitrogen公司生產(chǎn)的TA克隆試劑盒克隆，其載體為pCR@2.1。具體操作均參照有關(guān)說明書進(jìn)行。克隆產(chǎn)物的測序工作由北京三博生物技術(shù)有限公司完成。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)供試菌株的16S rDNA序列(基因庫登陸號：EF025338)，運(yùn)用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行同源序列搜索。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，下載相關(guān)菌種的16S rDNA序列，與供試菌株的序列放在一起，用MEGA4.0 軟件[22]的升級版4.1進(jìn)行匹配排列，然后采用鄰接法(Neighbor-Joining)[23]進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建。

1.8 重金屬對ZTS菌株氧化亞鐵影響的評估

在容量為250 mL的三角瓶中接入1.0 mL 種子于分別裝有各種不同濃度的金屬離子的99 mL 9 K培養(yǎng)基中, 根據(jù)上面的結(jié)果，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH和溫度為最適，在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min 條件下連續(xù)培養(yǎng)10 d, 然后采用重鉻酸鉀滴定法定時(shí)測定培養(yǎng)液中Fe2+的濃度，因蒸發(fā)失去的水分用無菌蒸餾水補(bǔ)充。試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)平行樣，所得結(jié)果為兩者的平均值。試驗(yàn)采用的金屬鹽均為硫酸鹽，購自中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)特征

革蘭氏染色結(jié)果表明，ZTS菌株為革蘭氏陰性。其透射電子顯微鏡顯示(見圖1)，該菌株為弧狀或螺旋狀。菌株的來源以及形態(tài)學(xué)分析結(jié)果表明，該菌株可能屬于鉤端螺旋菌屬的成員。

圖1 ZTS菌株的TEM像Fig.1 TEM image of strain ZTS

2.2 菌株的最適生長溫度

在9 K液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)ZTS菌株，F(xiàn)e2+(濃度為40 g/L)作為唯一的能源，初始溫度為15～45 ℃，pH為2.0，接種時(shí)間為72 h。細(xì)菌生長通過測定Fe2+的氧化量來確定。圖2所示為溫度對ZTS菌株氧化Fe2+的影響。從圖2可知， ZTS菌株能夠在15～40 ℃范圍內(nèi)生長，但15 ℃下生長非常緩慢，45 ℃下菌株的生長完全被抑制，其最適生長溫度為30 ℃左右。據(jù)文獻(xiàn)[24?26]報(bào)道，在鉤端螺旋菌屬的4個(gè)種，即氧化亞鐵鉤端螺旋菌、嗜熱氧化亞鐵鉤端螺旋菌、嗜鐵鉤端螺旋菌和固氮氧化亞鐵鉤端螺旋菌當(dāng)中，僅嗜熱氧化亞鐵鉤端螺旋菌和嗜鐵鉤端螺旋菌的某些成員能夠在45 ℃生長，因此，ZTS菌株只可能屬于氧化亞鐵鉤端螺旋菌、固氮氧化亞鐵鉤端螺旋菌和嗜鐵鉤端螺旋菌3個(gè)種當(dāng)中的某一成員。

圖2 溫度對生長3 d后ZTS菌株氧化Fe2+的影響Fig.2 Effect of temperature on Fe2+oxidation of strain ZTS grown for 3 d

2.3 菌株的最適生長pH

在9K液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)ZTS菌株，F(xiàn)e2+(濃度為40 g/L)作為唯一的能源，初始pH值為1.0～4.0，培養(yǎng)溫度為上述最適生長溫度，接種時(shí)間為72 h，其他培養(yǎng)條件同上。細(xì)菌生長通過測定Fe2+的氧化量來確定。圖3所示為pH對ZTS菌株氧化Fe2+的影響。從圖3可知，菌株適宜生長pH為1.5～3.5，ZTS菌株最適生長的pH為2.5；pH為1.0時(shí)，細(xì)菌生長受到強(qiáng)烈的抑制。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[24?26]報(bào)道的氧化亞鐵鉤端螺旋菌的適宜生長pH范圍相一致。

圖3 pH對ZTS菌株氧化Fe2+的影響Fig.3 Effect of initial pH values on Fe2+oxidation of by strain ZTS

2.4 酵母提取物對ZTS菌株氧化亞鐵的影響

通常認(rèn)為，自養(yǎng)細(xì)菌，特別是專性化能鐵氧化自養(yǎng)細(xì)菌對有機(jī)物都非常敏感。據(jù)此，本研究考察了不同濃度的酵母提取物對ZTS菌株氧化Fe2+活性的影響。圖4所示為酵母提取物對ZTS菌株氧化Fe2+的影響。從圖4可看出，當(dāng)培養(yǎng)基中酵母提取物的濃度低于0.03%(w/v)時(shí)，ZTS菌株的氧化Fe2+活性所受影響較??；當(dāng)酵母提取物濃度為0.09%時(shí)， ZTS菌株的氧化Fe2+活性被明顯抑制；而當(dāng)酵母提取物濃度為0.18%時(shí)，ZTS菌株的氧化Fe2+活性被完全抑制。ZTS菌株對低濃度酵母提取物的敏感性與VARDANYAN和AKOPYAN在2003年報(bào)道的兩株類鉤端螺旋菌的特性相一致[27]。

圖4 酵母提取物對ZTS菌株氧化Fe2+的影響Fig.4 Effect of yeast extract on Fe2+oxidation of strain ZTS

2.5 菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ZTS菌株的16S rDNA序列與GenBank、EMBL、DDBJ和PDB等核酸序列數(shù)據(jù)庫中鉤端螺旋菌屬其他已知成員的相應(yīng)序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。在本研究中，由于鉤端螺旋菌屬在分類地位上屬于硝化螺旋菌綱(NITROSPIRA)，因此，將Nitrospira moscoviensis當(dāng)作外類群(進(jìn)行分支分類研究時(shí)，一般需要確定外類群。外類群是指為了探知內(nèi)類群(指被研究的對象)的演化關(guān)系而借助比較的外部類群，它與內(nèi)類群在演化關(guān)系上是最為接近的類群，具有最相近的祖先，且在進(jìn)化程度上低于內(nèi)類群)。根據(jù)文獻(xiàn)[25?26]報(bào)道，基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，鉤端螺旋菌屬可分成I、II和III組(這種分類與以G+C含量為標(biāo)準(zhǔn)劃分的3類是一致的)，其中氧化亞鐵鉤端螺旋菌49879菌株是第I組的典型代表，嗜鐵鉤端螺旋菌Fairview菌株是第II組的典型代表，固氮氧化亞鐵鉤端螺旋菌UBA1菌株是第III組的唯一代表。從圖5可知，下載的所有成員可分成明顯的3大組。ZTS菌株與第I組的氧化亞鐵鉤端螺旋菌聚類在一起形成獨(dú)立的一個(gè)分支。從其序列相似性來看(見表2)，ZTS菌株與第I組典型菌株49879的序列相似性高達(dá)100%；它和第II組所有成員之間的16S rDNA序列一致性為92%～93%，與該組典型菌株Fairview的序列相似性也只有93%；它和第III組唯一的成員之間的16S rDNA序列一致性僅為83%。由此表明，ZTS菌株應(yīng)該屬于氧化亞鐵鉤端螺旋菌。

2.6 重金屬對ZTS菌株氧化亞鐵的影響

通常，在硫化礦的生物浸出過程中，當(dāng)其他條件相同時(shí)(如礦物種類、溫度和初始酸堿度等)，菌種的氧化Fe2+能力越強(qiáng)，抗金屬離子的濃度越高，其浸出作用就越強(qiáng)。因此，了解ZTS菌株的重金屬抗性能力具有重要的實(shí)踐意義。同時(shí)，F(xiàn)e2+氧化成高價(jià)鐵離子所釋放出的能量是氧化亞鐵鉤端螺旋菌獲得生長繁殖需要的唯一的能量來源，因此，本研究以考察不同濃度的重金屬離子對ZTS菌株氧化Fe2+能力的影響來表征菌株金屬抗性能力的強(qiáng)弱。

不同濃度的Cu2+、Co2+和Ni2+對ZTS菌株氧化Fe2+能力的影響見圖6。由圖6可知，與對照后相比，濃度為10 mmol/L的Cu2+或Ni2+對ZTS菌株氧化Fe2+能力幾乎沒有影響，培養(yǎng)基中的Fe2+(40 g/L)在2 d內(nèi)被完全氧化，而10 mmol/L的Co2+對ZTS菌株氧化Fe2+能力的影響非常明顯，培養(yǎng)基中的Fe2+需要6 d才被完全氧化；在20 mmol/L時(shí)，3種重金屬離子當(dāng)中，Co2+對ZTS菌株表現(xiàn)出最強(qiáng)的毒性，培養(yǎng)基中的Fe2+需要10 d才被完全氧化；當(dāng)Co2+和Cu2+濃度分別大于40和80 mmol/L時(shí)，ZTS菌株氧化Fe2+能力完全被抑制，而此時(shí)，ZTS菌株對處于相同濃度的Ni2+卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，高濃度的Ni2+只是延長了培養(yǎng)基中Fe2+被完全氧化的時(shí)間。上述結(jié)果表明，3種重金屬Cu2+、Co2+和Ni2+對ZTS菌株的毒性強(qiáng)弱順序依次為：Co2+＞Cu2+＞Ni2+。

圖5 基于16S rDNA序列構(gòu)建的ZTS以及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences of strain ZTS and relative strains (N. moscoviensis has been acted as the outgroup)

表2 ZTS菌株與鉤端螺旋菌屬已知成員的16S rDNA序列的相似性比較Table 2 16S rDNA sequences similarity(%) between strain ZTS and given members of genus Leptospirillum

圖6 不同濃度的Cu2+、Co2+和Ni2+對ZTS菌株氧化Fe2+能力的影響Fig.6 Effect of Cu2+(a), Co2+(b) and Ni2+(c) on Fe2+-oxidized ability of strain ZTS (C: Inoculated flasks without metal addition)

據(jù)SAND等[2]報(bào)道，氧化亞鐵鉤端螺旋菌對Co2+非常敏感，其耐受Co2+的質(zhì)量濃度小于2 g/L，而本研究的ZTS菌株耐受Co2+的質(zhì)量濃度與其結(jié)果基本一致，表明氧化亞鐵鉤端螺旋菌種內(nèi)菌株間的Co2+抗性可能具有相對的穩(wěn)定性。另外，他們通過比較研究嗜酸氧化亞鐵硫桿菌、嗜酸氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵鉤端螺旋菌對重金屬的抗性，認(rèn)為氧化亞鐵鉤端螺旋菌與嗜酸氧化亞鐵硫桿菌對Cu2+和Ni2+的抗性相當(dāng)，但存在同種菌株間的異質(zhì)性。就Cu2+抗性而言，氧化亞鐵鉤端螺旋菌對Cu2+的耐受能力高的可達(dá)25 g/L(相當(dāng)于400 mmol/L的Cu2+)，低的也有20g/L；而本研究中ZTS菌株的Cu2+的耐受能力低于80 mmol/L。這一結(jié)果與SAND等[2]報(bào)道的結(jié)果相差較大，這進(jìn)一步證實(shí)了菌株間異質(zhì)性的存在。盡管如此，ZTS菌株經(jīng)過近一年的馴化后，其Cu2+的抗性也可以達(dá)到300 mmol/L,即19.2 g/L(數(shù)據(jù)未顯示)；至于Ni2+抗性，SAND等[2]報(bào)道的結(jié)果是氧化亞鐵鉤端螺旋菌的抗Ni2+能力達(dá)8 g/L，約相當(dāng)于134 mmol/L的Ni2+。而圖6表明，對于測試的3種重金屬離子，ZTS菌株對Ni2+也顯示出較高的耐受能力，鑒于此，ZTS菌株對Ni2+分別在160和320 mmol/L的耐受性也被測試。結(jié)果表明，當(dāng)Ni2+濃度為160 mmol/L時(shí)，ZTS菌株經(jīng)過20 d的培養(yǎng)后，培養(yǎng)液中的Fe2+被完全氧化；而當(dāng)Ni2+濃度為320 mmol/L時(shí)，ZTS菌株即使經(jīng)過35 d的培養(yǎng)后，培養(yǎng)液中的Fe2+濃度仍然與無菌空白對照培養(yǎng)液中的Fe2+濃度相當(dāng)(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明ZTS菌株至少能夠耐受160 mmol/L(9.44 g/L)的Ni2+。另外，在SAND等[2]的報(bào)道中，對氧化亞鐵鉤端螺旋菌而言，Ni2+的毒性比Cu2+大得多，但本研究中ZTS菌株的Ni2+抗性能力卻比Cu2+抗性高得多，這可能與其本身的遺傳特性有關(guān)。因此，抗高濃度Ni2+的氧化亞鐵鉤端螺旋菌ZTS菌株的分離，為后續(xù)研究氧化亞鐵鉤端螺旋菌的鎳抗性遺傳機(jī)制提供了極好的材料。

3 結(jié)論

1) 從山西中條山銅礦廢棄的酸性礦坑水中分離出一株螺旋狀或弧狀細(xì)菌，命名為ZTS菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及核糖體16S RNA基因序列分析表明，ZTS菌株屬于氧化亞鐵鉤端螺旋菌(L. ferrooxidans)。

2) 重金屬抗性試驗(yàn)結(jié)果表明，ZTS菌株耐受Ni2+的能力可高達(dá)160 mmol/L，從而顯示出較好的應(yīng)用前景。同時(shí)，它的分離也為后續(xù)研究氧化亞鐵鉤端螺旋菌的鎳抗性遺傳機(jī)制提供了極好的材料。

REFERENCES

[1] KELLY D P, WOOD A P. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 50: 511?516.

[2] SAND W, GEHRKE T, HALLMANN R, RHODE K,SOBOTKE B, WENTZIEN S. In-situ bioleaching of metal sulfides: The importance of Leptospirillum ferrooxidans[C]//TORMA A E, WEY J E, LAKSHMANAN V I. Biohydrometallurgical Technologies.(Vol. 1), Warrendale, Pennsylvaia, 1993: 15?27.

[3] VERA M, PAGLIAI F, GUILIANI N, JEREZ C A. The chemolithoautotroph Acidithiobacillus ferrooxidans can survive under phosphate-limiting conditions by expressing a C-P lyase operon that allows it to grow on phosphonates[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(6): 1829?1835.

[4] NEMATI M, HARRISON, S T L. A comparative study on thermophilic and mesophilic biooxidation of ferrous iron[J]. Minerals Engineering, 2000, 13(1): 19?24.

[5] LI H M, KE J J. Influence of Ni2+and Mg2+on the growth and activity of Cu2+-adapted Thiobacillus ferrooxidans[J]. Hydrometallurgy, 2001, 61: 151?156.

[6] LEDUC L G, FERRONI G D. The chemolithotrophic bacterium Thiobacillus ferrooxidans[J]. FEMS Microbiology Reviews, 1994, 14: 103?120.

[7] LEDUC L G, FERRONI G D, TREVORS J T. Resistance to heavy metals in different strains of Thiobacillus ferrooxidans[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1997, 13: 453?455.

[8] DAS A, MODAK J M, NATARAJAN K A. Studies on multi-metal ion tolerance of Thiobacillus ferrooxidans[J]. Minerals Engineering, 1997, 10: 743?749.

[9] NOVO M T, DA SILVA A C, MORETO R, CABRAL P C, COSTACURTA A, GARCIAO, JR & OTTOBONI L M. Thiobacillus ferrooxidans response to copper and other heavy metals: Growth, protein synthesis and protein phosphorylation[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2000, 77: 187?195.

[10] KIM S D, BAE J E, PARK H S, CHA D K. Bioleaching of cadmium and nickel from synthetic sediments by Acidithiobacillus ferrooxidans[J]. Environmental Geochemistry and Health, 2005, 27(3): 229?235.

[11] LOMBARDI A T, GARCIA O, MOZETO A A. Bioleaching of metals from anaerobic sewage sludge: Effects of total solids, leaching microorganisms, and energy source [J]. Journal of Environmental Science and Health, Part A: Toxic/Hazardous Substances & Environmental Engineering, 2001, 36: 793?806.

[12] CHEN B Y, LIU H L, CHEN Y W, CHENG Y C. Dose-response assessment of metal toxicity upon indigenous Thiobacillus thiooxidans BC1[J]. Process Biochemistry, 2004, 39: 735?745.

[13] BARREIRA R P R, VILLAR L D, GARCIA O. Tolerance to copper and zinc of Acidithiobacillus thiooxidans isolated from sewage sludge[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005, 21: 89?91.

[14] KONISHI Y, TOSHIDO S, ASAI S. Bioleaching of pyrite by acidophilic thermophile Acidianus brierleyi[J]. Biotechnology and Bioengieering, 1995, 48: 592?600.

[15] VITAYA V B, LOIZUMI J, TODA K A. Kinetic assessment of substantial oxidation by Sulfolobus acidocaldarius in pyrite dissolution[J]. Journal of Fermentation Bioengineering, 1994, 77(5): 528?534.

[16] 丁建南, 朱若林, 康 健, 張成桂, 吳學(xué)玲, 邱冠周. 喜溫嗜酸硫桿菌YN12菌株的鑒定及其鎘抗性能[J]. 中國有色金屬學(xué)報(bào), 2008, 18(2): 342?348. DING Jian-nan, ZHU Ruo-lin, KANG Jian, ZHANG Cheng-gui, WU Xue-ling, QIU Guan-zhou. Identification and cadmium (Ⅱ) resistance of strain YN12, Acidithiobacillus caldus[J]. The Chinese Journal of Nonferrous Metals, 2008, 18(2): 342?348

[17] NORRIS P R, PARROTT L, MARSH R M. Moderately thermophilic mineral-oxidizing bacteria[J]. Biotechnology and Bioengineering Symposium, 1986, 16: 253?262.

[18] 高 健, 康 健, 吳學(xué)玲, 徐 競競, 李邦梅, 邱冠周. Fe2+對嗜鐵鉤端螺旋菌(L. ferriphilum)生長活性的影響[J]. 中國有色金屬學(xué)報(bào), 2008, 18(1): 159?162. GAO Jian, KANG Jian, WU Xue-ling, XU Jing, LI Bang-mei, QIU Guan-zhou. Effect of Fe2+on growth activity of L. ferriphilum[J]. The Chinese Journal of Nonferrous Metals, 2008, 18(1): 159?162.

[19] GAO J, ZHANG C G, WU X L, WANG H H, QIU G Z. Isolation and identification of a strain of L. ferriphium from an acid mine adrainage site[J]. Annals of microbiology, 2007, 57(2): 171?176.

[20] VOGEL A I. A textbook of quantitative chemical analysis[M]. London: Longmam, 1962: 309?319.

[21] GüRTLER V, STANISICH V A. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region[J]. Microbiology, 1996, 142: 3?16.

[22] TAMURA K, DUDLEY J, NEI M, KUMAR S. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8): 1596?1599.

[23] SAITOU N, NEI M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4: 406?425.

[24] HIPPE H. Leptospirillum gen. nov.(ex Markosyan 1972), nom. rev., including Leptospirillum ferrooxidans sp. nov.(ex Markosyan 1972) nom. rev. and Leptospirillum thermoferrooxidans sp. nov.(GOLOVACHEVA et al. 1992)[J]. International Journal of Systematic and Evolutional Microbiology, 2000, 50: 501?503.

[25] CORAM N J, RAWLINGS D E. Molecular relationship between two groups of Leptospirillum and the finding that the world and the Leptospirillum ferriphilum sp. nov. dominates South African commercial biooxidation tanks that operate at 40℃[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68: 838?845.

[26] TYSON G W, LO I, BAKER B J, ALLEN E E, HUGENHOLTZ P, BANFIELD J F. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(10): 6319?6324.

[27] VARDANYAN N S, AKOPYAN V P. Leptospirillum-like bacteria and evaluation of their role in pyrite oxidation[J]. Mikrobiologiya, 2003, 72(4): 493?497.

(編輯 何學(xué)鋒)

Identification and heavy metal toxicity assessment upon Fe2+-oxidizing ability of Leptospirillum-like bacterium isolated from acid mine drainage

GAO Jian1, DING Jian-nan2, KANG Jian1, WU Xue-ling2, QIU Guan-zhou2
(1. School of Life Science, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, China; 2. School of Resources Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China)

Using a dilution method, an iron-oxidizing bacterium, designated strain ZTS, was isolated from acid mine drainage of Zhongtiaoshan Copper Mine, Shanxi Province, China. Cells of strain ZTS were spiral or curved-shaped, gram-negative, and the optimum temperature was 30 ℃ and the optimum pH was 2.5. The strain ZTS was sensitive to low concentration of yeast extract. The cell shape, physiological characteristics and 16S rDNA sequence analysis indicated that the strain ZTS should belong to the species of Leptospirillum ferrooxidans. Considering its recent commercial interest, the effects of copper (Cu2+), cobalt (Co2+) and nickel (Ni2+) on strain ZTS were investigated during the oxidation of a ferrous iron solution (40 g/L). The results show that copper, cobalt and nickel individually inhibit the ferrous iron oxidation in the order Co2+＞Cu2+＞Ni2+. Interestingly, the nickel resistance capability of strain ZTS, which can resist nickel of 160 mmol/L, is much stronger than that of Leptospirillum ferrooxidans reported ago. This ability of strain ZTS may be relevant to its genetic characteristics.

acid mine drainage; Leptospirillum ferrooxidans; iron oxidation ability; heavy metal resistance

1004-0609(2011)01-0220-07

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2010CB630900)

2010-01-28；

2010-06-07

邱冠周, 教授, 博士；電話: 0731-88879815; E-mail: qgzfblw@yahoo.com.cn