張 曉 君, 孫 慶 元, 王 建 軍

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

蟲草菌[Cordycepssinensis(Berkey) Sacc.]隸屬于真菌界(Fungi)、子囊菌門(Ascomycota)、子囊菌綱(Ascomycetes)、糞殼菌亞綱(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)[1-3]。一般蟲草菌侵染寄主后,菌絲體分化形成墊狀結(jié)構(gòu)即子座。子座膨大并產(chǎn)生子實體,即子囊殼,成熟的子囊殼中產(chǎn)生子囊和子囊孢子。在野外蟲草菌孢子在夏季萌發(fā)侵染土壤中的蝙蝠蛾幼蟲后,形成的子座在次年5月份長出地面[4],貌似草,這種蝙蝠蛾幼蟲與蟲草菌的復(fù)合體稱為冬蟲夏草。冬蟲夏草主要分布于我國的青藏高原海拔3 500～5 000 m的高山草甸或高山灌叢草甸,在四川、云南和甘肅也有少量分布[5]。作者從野外采集的冬蟲夏草中分離無性型蟲草菌株,對菌蟲體組織和子座組織萌發(fā)、無性型蟲草菌株菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察,同時對無性型蟲草菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分進(jìn)行了優(yōu)化,以期為人工培育冬蟲夏草以及無性型蟲草菌株發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 冬蟲夏草

新鮮冬蟲夏草,采自四川省阿壩藏族羌族自治州黑水縣,冰箱中4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯20%,葡萄糖2%,VB10.01%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,瓊脂2%,pH 6.0。用于無性型蟲草菌株的分離。

斜面培養(yǎng)基(1%牛肉粉PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯20%,葡萄糖2%,牛肉粉1%,VB10.01%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,瓊脂2%,pH 6.0。用于無性型蟲草菌株的保藏。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖3%,牛肉粉2%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,VB10.01%,pH 6.0。用于無性型蟲草菌株的發(fā)酵。

2 實驗方法

2.1 分 離

用水清洗冬蟲夏草表面的雜質(zhì),在無菌條件下分別用0.1%氯化汞、75%酒精對冬蟲夏草進(jìn)行表面消毒,無菌水沖洗多次[6],以頭部為界將其剪開,生長子座的頭部稱為子座組織,頭部以外的稱為菌蟲體組織。將子座及菌蟲體組織分別放入分離培養(yǎng)基中,在18 ℃培養(yǎng),觀察,重復(fù)3次,統(tǒng)計萌發(fā)情況,并且挑取萌發(fā)的菌絲體進(jìn)一步分離純化后接入斜面培養(yǎng)基保藏。

2.2 生長觀察

將分離的無性型蟲草菌株qsun-1分別接入PDA及1%牛肉粉PDA平板中,18 ℃培養(yǎng),觀察生長情況。同時將接有無性型蟲草菌株qsun-1的PDA培養(yǎng)基放在15、18、25、32 ℃培養(yǎng),觀察生長情況。以菌落直徑作為衡量生長情況的指標(biāo),每隔5 d測量1次。

2.3 顯微結(jié)構(gòu)觀察

無菌操作,用接種棒從液體培養(yǎng)基中挑取菌絲,放在滴有純化水的載玻片上,輕輕將菌絲展開,不染色直接用顯微鏡進(jìn)行觀察[7]。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

將無性型蟲草菌株qsun-1在1%牛肉粉PDA液體培養(yǎng)基中活化3 d,以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵條件:裝液量每250 mL裝100 mL,溫度18 ℃,搖床轉(zhuǎn)速120 r/min,時間5 d。發(fā)酵結(jié)束后3 000 r/min離心10 min分離菌絲體,烘干稱重。

以葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉及甘露醇為碳源,確定最佳碳源。確定蔗糖為最佳碳源后,分別考察1%、2%、3%、4%、5%蔗糖對無性型蟲草菌株qsun-1菌體生長的影響,確定最佳蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以牛肉粉、蛋白胨、NaNO3、(NH4)2SO4及尿素為氮源,確定最佳氮源。確定蛋白胨為最佳氮源后,分別考察0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%蛋白胨對無性型蟲草菌株qsun-1菌體生長的影響,確定最佳蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)。上述條件確定后依次考察0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25% MgSO4和KH2PO4對無性型蟲草菌株qsun-1菌體生長的影響,確定最佳的MgSO4、KH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[8-10]。

3 結(jié)果與分析

3.1 萌發(fā)和分離

對新鮮冬蟲夏草不同部位進(jìn)行分離,得到無性型蟲草菌株qsun-1(表1)。由表1可以看出,冬蟲夏草子座組織的菌體萌發(fā)率為60%,而菌蟲體組織的菌體萌發(fā)率僅達(dá)到14%,可見子座組織菌絲體容易萌發(fā),而菌蟲體組織可能由于易受雜菌污染而使萌發(fā)受阻。因此,作者從冬蟲夏草子座中培養(yǎng)并分離了無性型蟲草菌株。

3.2 生長特點

3.2.1 菌落形態(tài)

無性型蟲草菌株qsun-1在PDA和1%牛肉粉PDA平板中生長10 d后菌落形態(tài)有所不同(圖1)。在PDA培養(yǎng)基中菌落稍微隆起,中心凹陷并有少量水珠,灰白色,菌絲較短,菌落周圍有一透明圈[圖1(a)],菌落背面暗黃色[圖1(b)],菌落直徑21 mm。在1%牛肉粉PDA培養(yǎng)基中菌落明顯隆起,純白色,菌絲粗壯[圖1(c)],菌落背面淡黃色[圖1(d)],菌落直徑30 mm。

圖1 菌株qsun-1菌落形態(tài)

3.2.2 菌落生長情況

無性型蟲草菌株屬于嗜低溫菌株,對溫度變化反應(yīng)顯著。在不同溫度下培養(yǎng)的無性型菌株qsun-1生長狀況也不同(表2)。無性型蟲草菌株qsun-1在15～18 ℃生長良好,在25 ℃生長受到抑制, 在32 ℃條件下未發(fā)現(xiàn)菌株生長。

表2 不同溫度下菌株qsun-1菌落直徑

3.3 顯微結(jié)構(gòu)

對無性型蟲草菌株qsun-1液體培養(yǎng)物進(jìn)行顯微觀察,從顯微結(jié)構(gòu)可以看到液體培養(yǎng)的菌絲主要為管狀菌絲,菌絲有較明顯的分隔,粗細(xì)均勻,每節(jié)菌絲均透明(圖2)。

圖2 菌株qsun-1顯微結(jié)構(gòu)(×250)

3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

3.4.1 碳源對qsun-1生長的影響

無性型蟲草菌株qsun-1可以利用多種碳源。當(dāng)蔗糖為碳源時生長最好,菌體產(chǎn)量達(dá)到8.0 g/L,其次是果糖、甘露醇、淀粉和葡萄糖(表3)。

3.4.2 蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對qsun-1生長的影響

無性型蟲草菌株qsun-1在蔗糖為1%時生長較慢；在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2%時,生長量最大； 當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過2%時,菌體生長受到一定程度的抑制；當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%時,菌體生長明顯受阻(圖3)。

圖3 蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株qsun-1生長的影響

3.4.3 氮源對qsun-1生長的影響

無性型蟲草菌株qsun-1可利用多種氮源。當(dāng)以蛋白胨為氮源時生長最好,菌體產(chǎn)量達(dá)到8.1 g/L,其次為NaNO3、牛肉粉、(NH4)2SO4。以尿素為氮源時,未見無性型蟲草菌株qsun-1生長(表4)。

3.4.4 蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對qsun-1生長的影響

無性型蟲草菌株qsun-1在蛋白胨為0.5%時,生長緩慢;隨著蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加生長量逐漸增加,在蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2%時,菌體生長達(dá)到最大值;蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過2%后,菌體生長受到抑制(圖4)。

圖4 蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株qsun-1生長的影響

3.4.5 MgSO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對qsun-1生長的影響

無性型蟲草菌株qsun-1在MgSO4為0.05%時生長較慢,在MgSO4達(dá)到0.1%時生長量達(dá)最大;MgSO4超過0.1%后生長受到一定程度的抑制,并隨著MgSO4濃度的增加而抑制程度增加(圖5)。

圖5 MgSO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株qsun-1生長的影響

3.4.6 KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對qsun-1生長的影響

無性型蟲草菌株qsun-1在KH2PO4為0.05%時生長較慢,隨著KH2PO4濃度的增加生長量逐漸增加,在0.2%左右時達(dá)到最大值,在超過0.2%后菌體生長受到抑制(圖6)。

圖6 KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株qsun-1生長的影響

4 結(jié) 論

冬蟲夏草子座組織菌絲體容易萌發(fā),而菌蟲體組織中可能由于易受雜菌污染菌絲體萌發(fā)受阻。作者從冬蟲夏草子座中培養(yǎng)并分離出無性型蟲草菌株qsun-1。通過在PDA和1%牛肉粉PDA中培養(yǎng)無性型蟲草菌株qsun-1,發(fā)現(xiàn)1%牛肉粉PDA更適于qsun-1生長,qsun-1在1%牛肉粉PDA培養(yǎng)10 d,菌落明顯隆起,純白色,菌絲粗壯,菌落背面淡黃色,菌落直徑30 mm。觀察qsun-1的顯微結(jié)構(gòu),可以看到液體培養(yǎng)的菌絲主要為管狀菌絲,菌絲有較明顯的分隔,粗細(xì)均勻,每節(jié)菌絲均透明。通過在不同溫度下培養(yǎng)菌株qsun-1,發(fā)現(xiàn)其生長溫度范圍在15～18 ℃。無性型蟲草菌株qsun-1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:蔗糖2%,蛋白胨2%,MgSO40.1%,KH2PO40.2%。

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