張 建 雙, 于 爽, 郭 曉 兵, 郭 繼 強

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

海藻糖[1]由兩分子的吡喃葡萄糖單體以α-1,1糖苷鍵連接而成,許多報道[2]表明當酵母細胞處于長時間的饑餓、高滲、熱激以及孢子萌發(fā)等時,細胞內海藻糖的含量會發(fā)生顯著變化。因此海藻糖不僅可以作為碳源和能源,還具有保護生物細胞和生物活性物質在脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒試劑等不良環(huán)境條件下活性免遭破壞的功能[3]。我國主要通過酵母法進行工業(yè)化生產[4]。酵母中的海藻糖合成酶[5]屬胞內酶,通常需先將細胞破碎,經分離純化[6]后才可使用,酶活損失較大,制約了酶法生產的工業(yè)化應用。采用滲透處理細胞技術可省去海藻糖合成酶的分離及純化,整個透性化細胞可視為一個固定化酶。

透性化處理可使細胞內合成的目標產物釋放到細胞外,從而減少產物積累造成的產物反饋抑制現象[7]。作者以透性化酒精酵母細胞為研究對象,采用響應面法對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化,從而使海藻糖最大限度的積累。

1 實 驗

1.1 菌 種

酒精酵母,大連工業(yè)大學生物工程學院微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20,硫酸鎂 0.5,磷酸氫二鉀10,氯化鈉20,酵母膏10。

1.2.2 試 劑

葡萄糖、酵母膏、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、蔗糖、吐溫-60、無水乙醇、蒽酮、濃硫酸等。

1.3 方 法

1.3.1 培養(yǎng)條件

發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL的三角瓶裝液80 mL,透性化細胞1 g,30 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。

1.3.2 酵母細胞滲透處理

取1 g濕酵母細胞懸浮于15 mL體積分數為0.5% 的吐溫60溶液中,于30 ℃下振蕩反應45 min,離心,收集菌體。菌體再用50 mmol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液重復洗滌2次,離心,最終收集的菌體即為透性化酵母細胞。

1.3.3 生物合成海藻糖

將透性化細胞加入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3.4 海藻糖質量濃度的測定

用0.5 mol/L的三氯乙酸冰浴提取胞內海藻糖1 h[8],提取2次,提取液用蒽酮比色法測定海藻糖質量濃度,并測出對應的菌體生物量。每組實驗平行3次,結果取平均值。

1.3.5 菌體生物量的測定

取發(fā)酵液10 mL于4 000 r/min離心15 min,沉淀,用去離子水洗滌2次,在干燥箱中80 ℃下烘干至恒重,稱量菌體干重。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.4.1 透性化酒精酵母培養(yǎng)基最適碳源的確定

改變“1.2.1”中發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的種類,分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖作為碳源,添加量為20 g/L,其他成分不變。30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h,離心收集菌體,測定海藻糖質量濃度及菌體干重。

1.4.2 透性化酒精酵母培養(yǎng)基最適氮源的確定

以30 g/L的蔗糖為碳源,選用有機氮源(牛肉膏、酵母膏、蛋白胨)、無機氮源(硫酸銨、尿素)單一或復合物作為氮源,添加量為10 g/L,其他成分不變,30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h,離心收集菌體,測定海藻糖質量濃度及菌體干重。

1.4.3 透性化酒精酵母培養(yǎng)基最適鹽濃度的確定

以30 g/L蔗糖為碳源,15 g/L酵母膏為碳源,分別添加10、20、30、40、50 g/L的氯化鈉和氯化鉀[9],其他成分不變,30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h,離心收集菌體,測定海藻糖質量濃度及菌體干重。

1.4.4 響應面法對海藻糖產生培養(yǎng)基的優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上,通過Box-Behnken設計進一步確定單因素的最佳添加量。以蔗糖、酵母膏、氯化鈉為自變量,以海藻糖質量濃度為考察指標,運用Minitab15數據處理軟件進行響應面分析,對培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化。

2 結果與討論

2.1 最佳碳源及其質量分數的確定

由圖1可以看出,不同碳源對酵母細胞的生長及海藻糖的積累影響較大。當以蔗糖為碳源時,海藻糖質量濃度和菌體干重均較高,且分別達到0.739和5.73 g/L。

圖1 不同碳源對海藻糖產量的影響

進一步考察最適的蔗糖質量分數,結果見圖2。由圖2可知,蔗糖的濃度對海藻糖的積累具有較為顯著的影響,當蔗糖質量濃度為30 g/L時海藻糖質量濃度達到最大值0.831 g/L,菌體干重為6.73 g/L。濃度繼續(xù)增加,海藻糖質量濃度開始降低,故蔗糖的量取30 g/L。

圖2 蔗糖對海藻糖產量的影響

2.2 最佳氮源及其質量分數的確定

由圖3可知,培養(yǎng)基中的不同碳源對酵母細胞海藻糖的積累及菌體的生長情況影響較大?？傮w看來,有機氮源的效果較好,其中酵母膏為氮源時效果最好,此時海藻糖質量濃度為0.833 g/L,菌體干重為6.56 g/L。

進一步考察最適酵母膏用量,結果見圖4。由圖4可知,不同濃度的酵母膏對海藻糖產量的影響較大。酵母膏濃度過低,菌體生長較差,產海藻糖能力低；當酵母膏添加量大于15 g/L時,菌體干重及海藻糖量增加不明顯。因此選擇15 g/L的酵母膏為最適添加量,海藻糖質量濃度為0.864 g/L,菌體干重為6.49 g/L。

1,牛肉膏10 g/L; 2,酵母膏10 g/L; 3,蛋白胨10 g/L; 4,牛肉膏5 g/L+硫酸銨5 g/L; 5,酵母膏5 g/L+硫酸銨5 g/L; 6,硫酸銨10 g/L; 7,尿素10 g/L

圖4 酵母膏對海藻糖產量的影響

2.3 最佳鹽及其質量分數的確定

由圖5、6可知,適當濃度的氯化鈉和氯化鉀均有利于海藻糖的積累,但兩者比較之后,可以看出添加氯化鈉得到的海藻糖質量濃度及菌體干重均較大,因此選擇添加30 g/L的氯化鈉,此時海藻糖質量濃度為0.910 g/L,菌體干重為6.44 g/L。

圖5 氯化鈉對海藻糖產量的影響

圖6 氯化鉀對海藻糖產量的影響

2.4 響應面法對海藻糖產生培養(yǎng)基的優(yōu)化

在單因素實驗結果的基礎上,進行Box-Behnken響應曲面設計,以海藻糖質量濃度為考察指標,因素水平編碼見表1。對實驗數據進行多項式擬合回歸,以海藻糖質量濃度(Y)為因變量,以酵母膏(X1)、蔗糖(X2)、氯化鈉(X3)質量濃度為自變量建立回歸方程：

Y=0.915 67-0.020 13X1-0.073 66X2-

0.006 5X1X3-0.002 075X2X3

表1 響應面設計因素與水平

從表2可知,海藻糖質量濃度與實驗3個因素的回歸方程的F值為463.59,方程顯著。回歸方程的一次項、二次項的均方差和系數比較大,且P<0.01,說明顯著；而交互項比較小,所以,響應面分析所選的3個因素(酵母膏、蔗糖和氯化鈉質量濃度)之間的交互效應比較小,且P>0.05。因此各項因素與海藻糖質量濃度之間是相對較為簡單的線性關系,失擬項P>0.05表明該方程可以接受,可以用此模型對發(fā)酵液的海藻糖質量濃度進行預測。

利用Minitab15數據處理軟件對回歸模型進行響應面分析,得到響應面以及對應等高線圖,見圖7。由圖7可以直觀地看出各個自變量對響應值的變化趨勢,而且回歸模型存在最大值,同時可以看出3個因素對海藻糖積累的影響顯著性為：酵母膏>蔗糖>氯化鈉。

根據擬合方程對方程求導,得到最佳因素編碼：X1=-0.062 3,X2=-0.245 4,X3=-0.256 6,即最適培養(yǎng)基組成為：酵母膏14.7 g/L,蔗糖32.5 g/L,氯化鈉27.4 g/L。由回歸方程可以確定海藻糖最大質量濃度為 0.931 9 g/L。

圖7 響應面三維圖和對應的等高線圖

2.5 驗證性實驗

為了檢驗模型的準確性,根據以上優(yōu)化實驗所得的各因素優(yōu)化值,進行透性化酒精酵母培養(yǎng)實驗,經優(yōu)化后其海藻糖的產量可以達到0.921 0 g/L,與預測值0.931 9 g/L接近,可見該模型能較好地預測實際發(fā)酵情況。

3 結 論

通過響應面法對透性化酒精酵母細胞發(fā)酵培養(yǎng)基組成的研究,得出最佳培養(yǎng)基組成為:酵母膏14.7 g/L,蔗糖32.5 g/L,氯化鈉27.4 g/L,此時海藻糖質量濃度達到0.931 9 g/L。

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