夏 清 風(fēng), 侯 英 敏, 曹 芳, 金 朝 霞

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人溶菌酶(Human Lysozyme, HLY)又稱胞壁質(zhì)酶,能水解細(xì)菌細(xì)胞壁中黏多糖的β(1→4)糖苷鍵,它是由130個(gè)氨基酸組成的堿性多肽,分子質(zhì)量為14.7 ku[1]。人溶菌酶參與機(jī)體的防御機(jī)制,有消炎、抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用,因而在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2-4]。與其他來(lái)源的溶菌酶相比,人溶菌酶具有許多獨(dú)特的優(yōu)越性,如活性是蛋清溶菌酶的3倍,且不易產(chǎn)生副作用和耐藥性[5]。但通常天然人溶菌酶是從人奶或胎盤(pán)中少量提取,制備材料相當(dāng)有限,來(lái)源極其困難,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需要,所以開(kāi)發(fā)重組人溶菌酶具有十分光明的市場(chǎng)前景。

畢赤酵母(P.pastoris)是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白具有基因操作簡(jiǎn)單、外源蛋白能正確加工與修飾、表達(dá)量高、易大量發(fā)酵培養(yǎng)、易純化等優(yōu)點(diǎn)[6],這使得畢赤酵母成為目前應(yīng)用較廣的分泌型真核表達(dá)系統(tǒng),已有許多成功高效表達(dá)外源蛋白的報(bào)道[7-8]。畢赤酵母不僅克服了原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)物不易分離純化和不能保持重組蛋白活性等缺點(diǎn),還具有其他酵母表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)[9]。作者亞克隆了人溶菌酶基因,利用pPIC9K穿梭質(zhì)粒,實(shí)現(xiàn)了人溶菌酶畢赤酵母高效表達(dá)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原 料

人胎盤(pán),大連市婦產(chǎn)醫(yī)院；酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K,大連工業(yè)大學(xué)；畢赤酵母(Pichiapastoris)菌株GS115,Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α、pGH質(zhì)粒、溶壁微球菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌,實(shí)驗(yàn)室保存；TRNzol總RNA提取試劑、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA回收試劑盒等,Tiangen公司；常用限制性內(nèi)切酶和連接酶,寶生物公司;G418、酵母氮源(YNB),上海生工公司；人溶菌酶標(biāo)品,北京鼎國(guó)生物公司；酵母培養(yǎng)分別采用完全培養(yǎng)基(YPD)、選擇培養(yǎng)基(MD)、誘導(dǎo)培養(yǎng)基(BMGY)和甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基(BMMY)。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的人溶菌酶基因序列(AK311779)設(shè)計(jì)能特異性擴(kuò)增人溶菌酶編碼基因的引物序列?？紤]到pPIC9K載體上已有α-factor的信號(hào)肽,故去掉人溶菌酶基因的18個(gè)氨基酸的自身信號(hào)肽序列,擴(kuò)增成熟蛋白編碼序列。為了便于將基因直接構(gòu)建在畢赤酵母表達(dá)載體 pPIC9K上,分別在上下游引物中引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列:

P1:5′-CGGAATTCATGAAGGTCTTTGAAAGGTGT- 3′,

P2:5′-TTGCGGCCGCTTACACTCCACAACCTTGAAC- 3′。

1.3 人胎盤(pán)組織總RNA的提取及cDNA模板的建立

取新鮮的人胎盤(pán)100 mg用無(wú)菌剪刀迅速處理成黃豆大小的塊,迅速冷凍在液氮中以防止RNA降解,按照TRNzol試劑盒說(shuō)明書(shū)冷凍研磨并提取人胎盤(pán)組織總RNA。 以人的總RNA為模板,利用TIANScript cDNA第1鏈合成試劑盒合成人胎盤(pán)組織cDNA第1條鏈。

1.4 人溶菌酶基因的PCR擴(kuò)增與克隆

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,P1和P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:10×PCR buffer 5 μL,MgCl23 μL,dNTP 4 μL,引物各1 μL,cDNA模板2 μL,TaqDNA聚合酶 0.5 μL,補(bǔ)水至總體積50 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,然后進(jìn)行(94 ℃ 30 s,54 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s)30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收并純化。將回收后的DNA片段與pGH載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒后HindⅢ酶切鑒定重組質(zhì)粒pGH-HLY,陽(yáng)性克隆質(zhì)粒由上海捷瑞生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

用EcoR Ⅰ和NotⅠ分別對(duì)pGH-HLY重組質(zhì)粒和pPIC9K質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,純化后將人溶菌酶基因與pPIC9K載體片段經(jīng)T4DNA連接酶于16 ℃連接,獲得真核重組表達(dá)載體pPIC9K-HLY；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選單個(gè)陽(yáng)性克隆菌落,提取重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.6 重組質(zhì)粒對(duì)畢赤酵母GS115 的轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒pPIC9K-HLY用SalⅠ酶線性化后,通過(guò)電轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115,同時(shí)轉(zhuǎn)化空載的pPIC9K作為陰性對(duì)照。將轉(zhuǎn)化的酵母經(jīng)過(guò)MD 培養(yǎng)基(酵母氮堿YNB 13.4 g/L,生物素0.4 mg/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂15 g/L)平板篩選出His+表型菌落,28 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d,然后接種到含G418質(zhì)量濃度梯度為0.5～4.0 g/L的YPD平板上,逐級(jí)篩選目的基因高拷貝重組菌株,最后選取長(zhǎng)勢(shì)最好的菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證。

1.7 重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

將高拷貝重組酵母菌株接種到BMGY培養(yǎng)基(酵母提取物10 g/L,胰蛋白胨20 g/L,YNB 13.4 g/L,生物素0.4 mg/L,pH 6.0磷酸緩沖液100 mmol,甘油1%)中,在30 ℃,220 r/min 的條件下培養(yǎng)OD600至2～6后,離心收集菌體,用等體積的BMMY(0.5%甲醇代替BMGY中的甘油)培養(yǎng)基重懸菌體,30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d后收集表達(dá)上清液,用75%飽和硫酸銨沉淀,透析濃縮,用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)產(chǎn)物,并利用Bradford法測(cè)定蛋白含量。

1.8 重組人溶菌酶蛋白抗菌活性檢測(cè)

采用平板擴(kuò)散法鑒定人溶菌酶的生物活性。將對(duì)數(shù)期的溶壁微球菌液稀釋到OD600約0.4,均勻涂布于培養(yǎng)基上,再在培養(yǎng)基上打孔(d=3 mm),取20 μL上清加入小孔內(nèi),37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h測(cè)量抑菌圈直徑。采用相同方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草桿菌的抑菌活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 人溶菌酶基因cDNA的PCR擴(kuò)增

通過(guò)RT-PCR反應(yīng),擴(kuò)增出大小約414 bp的人溶菌酶基因片段,與預(yù)期結(jié)果一致,電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收并純化PCR產(chǎn)物,用于下一步的連接反應(yīng)。

M,DL 2000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)；1、2,PCR產(chǎn)物

2.2 HindⅢ酶切鑒定

將含有成熟酶編碼基因序列的PCR產(chǎn)物與pGH載體連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,因?yàn)閜GH載體的多克隆位點(diǎn)上有2個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn),分別位于人溶菌酶基因片段兩側(cè)672 bp和1 118 bp處,故用HindⅢ單酶切陽(yáng)性質(zhì)粒后,可得到長(zhǎng)度約2.89 kb和446 bp的2條帶。酶切結(jié)果見(jiàn)圖2,與預(yù)期一致。

M,DNA 標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ；1,pGH-HLY/HindⅢ

2.3 人溶菌酶基因序列測(cè)定與分析

對(duì)經(jīng)酶切鑒定的重組質(zhì)粒克隆進(jìn)行測(cè)序。基因測(cè)序結(jié)果用BLAST程序比較,該序列與GenBank上登錄號(hào)AK3117792的人溶菌酶編碼基因序列完全相同(去除了信號(hào)肽序列)。序列分析表明:該基因長(zhǎng)度為414 bp,包含編碼130個(gè)氨基酸殘基的人溶菌酶成熟肽的完整序列,ATG、TAA以及引入的保護(hù)性堿基和酶切位點(diǎn)24 bp。

2.4 重組表達(dá)載體pPIC9K-HLY的構(gòu)建與鑒定

將HLY編碼基因定向克隆至畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k的EcoRⅠ和NotⅠ位點(diǎn),重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗(yàn)證,酶切片斷與目的基因大小相一致。該結(jié)果表明人溶菌酶基因已經(jīng)成功插入pPIC9K載體,重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和酶切鑒定結(jié)果分別見(jiàn)圖3、4。DNA測(cè)序結(jié)果顯示其基因序列與讀碼框架均正確。

圖3 重組表達(dá)載體pPIC9K-HLY的結(jié)構(gòu)

M,DL10000 標(biāo)準(zhǔn)；1,pPIC9K-HLY/EcoRⅠ+NotⅠ

2.5 重組酵母菌株的構(gòu)建與鑒定

pPIC9K-HLY用SalⅠ酶切線性化的載體轉(zhuǎn)化在MD平板上可長(zhǎng)出158個(gè)His+轉(zhuǎn)化子,進(jìn)一步通過(guò)G418篩選獲得高拷貝克隆。用PCR方法鑒定重組菌株,即提取重組菌株的染色體DNA為模板,以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。挑取的4 個(gè)菌落均擴(kuò)增出預(yù)期大小的目標(biāo)條帶,而對(duì)照則無(wú)(圖5),表明人溶菌酶基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入并整合到酵母基因組上。

1～4,人溶菌酶基因的酵母轉(zhuǎn)化子；5,pPIC9K空載轉(zhuǎn)化的酵母

2.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)

選取陽(yáng)性GS115/pPIC9K-HLY重組菌株,收集發(fā)酵上清液經(jīng)沉淀濃縮后進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳分析,同時(shí)用pPIC9K/Yeast空載轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物作對(duì)照。結(jié)果顯示:與對(duì)照相比,發(fā)酵培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到分泌表達(dá)的15 ku的外源蛋白,分子質(zhì)量與國(guó)外報(bào)道以及氨基酸序列推導(dǎo)的大小一致,表達(dá)產(chǎn)物占上清中總蛋白的32%。在誘導(dǎo)表達(dá)48 h開(kāi)始分泌表達(dá),72 h表達(dá)量達(dá)最高(圖6)。

1,誘導(dǎo)48 h；2,陰性對(duì)照；3,誘導(dǎo)72 h；4、5,濃縮樣

2.7 重組人溶菌酶蛋白抑菌活性檢測(cè)

對(duì)4種菌的抑菌活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)如圖7所示,溶菌圈的直徑為0.4～1.4 cm,表明重組人溶菌酶蛋白對(duì)溶壁微球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌均有不同程度的抑菌作用。

1,溶壁微球菌；2,大腸桿菌；3,金黃色葡萄球菌；4,枯草桿菌

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)以人溶菌酶基因?yàn)檠芯繉?duì)象,利用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增了去除人溶菌酶內(nèi)含子及其信號(hào)肽序列的編碼人溶菌酶基因片段,包含編碼130個(gè)氨基酸殘基的人溶菌酶成熟肽的完整序列,將其與酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K連接后,成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的重組菌株,研究結(jié)果為實(shí)現(xiàn)人溶菌酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

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