蘇哲君，顏 勇，陳志宏

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院)

脾是機(jī)體重要的免疫器官，脾的功能在整個機(jī)體的免疫功能中占有重要地位[1];補腎、健脾是延緩衰老的重要方法。天年飲由劉河間《宣明論方》何首烏丸加味而成，能填精補髓、烏發(fā)延年。本研究采用D-半乳糖致亞急性衰老的大鼠模型，觀察天年飲對衰老大鼠脾p53表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 30只雄性SD大鼠(體重180-250g)隨機(jī)分為3組:正常組、衰老模型組和天年飲用藥組，每組10只。模型組和用藥組大鼠均采用D-半乳糖連續(xù)腹腔注射(200mg/kg/d，40d)的方法建立亞急性衰老的動物模型;模型組大鼠造模成功后不再做任何處理，用藥組大鼠造模成功后給予天年飲(16.2g/kg /d)灌胃30d。

1.2 藥品與試劑 天年飲由灸何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿、丹參、茯苓六味中藥組成，熬制后每ml含生藥1.5g。p53免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程公司。

1.3 檢測脾臟指數(shù) 大鼠稱重，斷頭處死，取出脾臟后去除脂肪、筋膜后稱重，計算脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)=脾臟重量/體重。

1.4 免疫組化染色及定量分析 稱重后的脾臟入Bouin液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚6μm)，貼于涂有APES的載玻片上。采用SABC免疫組化染色觀察大鼠脾p53的表達(dá)情況(一抗為兔抗，稀釋比例為1:100)，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，以PBS代替一抗作為陰性對照。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析:p53陽性切片在10×20倍顯微鏡下選取視野，計算陽性產(chǎn)物面積占視野面積的百分比。每只動物任選5張切片，每張切片選取3個視野，取平均值。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，以方差分析進(jìn)行統(tǒng)計處理，組間比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脾臟指數(shù) 與正常對照組比較,衰老模型組大鼠脾臟指數(shù)顯著下降(P＜0.05);中藥天年飲可明顯提高衰老大鼠的脾臟指數(shù)，用藥組與衰老組比較差異顯著(P＜0.05)。見附表。

2.2 各組大鼠脾p53的表達(dá) p53蛋白陽性產(chǎn)物為棕黃色，位于細(xì)胞核。定量分析結(jié)果見附表:模型組大鼠脾p53的表達(dá)明顯高于模型組大鼠(P＜0.05);中藥天年飲灌胃可明顯降低模型大鼠脾p53的表達(dá)，與模型組比較，用藥組大鼠脾p53的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。

附表 各組大鼠脾臟指數(shù)和脾p53的表達(dá)(±s，n=10)

附表 各組大鼠脾臟指數(shù)和脾p53的表達(dá)(±s，n=10)

與正常組比較:P＜0.05;與模型組比較:P＜0.05

組別 脾臟指數(shù) p53正常組 0.466±0.063 0.0254±0.0111衰老模型組 0.347±0.0991 0.0598±0.01041天年飲用藥物 0.451±0.1112 0.0352±0.01062

3 討論

p53基因可參與細(xì)胞周期的調(diào)控，具有阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組的穩(wěn)定及抑制腫瘤血管生成等多方面的功能[2]。p53 可通過bax/bcl-2、Fas/Apol、IGF-Bp3 等蛋白完成對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用;p53還可以通過死亡受體蛋白等途徑誘導(dǎo)凋亡;另外還有學(xué)者認(rèn)為p53還可直接刺激線粒體釋放高毒性的氧自由基來引發(fā)凋亡[3]。真核細(xì)胞在進(jìn)化過程中形成了一整套高度保守的糾錯系統(tǒng)，當(dāng)DNA出現(xiàn)異常時，p53蛋白及其轉(zhuǎn)錄活動明顯增多，并使細(xì)胞周期停留在G1期，而不能進(jìn)入S期，以便DNA修復(fù)，而不致復(fù)制有缺陷的DNA。如果DNA破壞嚴(yán)重不能修復(fù)，則p53可直接命令細(xì)胞凋亡[4]。

脾是機(jī)體重要的免疫器官，在異種抗原的刺激下脾小體分化增殖，產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞，動脈周圍淋巴鞘顯著增厚，產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞，這些變化均與體液免疫和細(xì)胞免疫密切相關(guān)。另外，脾還能產(chǎn)生與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的活性物質(zhì)，脾的功能在整個機(jī)體的免疫功能中占有重要地位[1]。

延緩衰老的主要目的是提高生活質(zhì)量、改善體質(zhì)并有效延長機(jī)體壽命。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可明顯降低衰老大鼠脾p53的表達(dá)，表明天年飲可通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖能力來提高衰老機(jī)體的免疫功能，從而有助于防治老年病和延緩機(jī)體的衰老過程，說明中藥天年飲具有一定的延緩衰老作用。

[1]Cesta MF.Normal structure,function and histology of the spleen[J].Toxicol Pathol,2006, 34(5):455-465.

[2]Takeuchi A, Mishina Y, Miyaishi O, et al. Heterozygosity with respect to Zfp148 causes complete loss of fetal germ cells during mouse embryogenesis[J].Nat Genet,2003,33(2):172-176.

[3]Oda E,Ohki R,Murasawa H,et al.Noxa,a BH3-only member of the bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis[J].Science,2000,288(5468):1053-1058.

[4]Finlay CA,Hinds PW,Levine AJ.The p53 proto-nocogene can act as a suppressor of transformation [J].Cell,1989,57(7):1083-1093.