宋成軍，楊振軍，陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德 067000)

研究認(rèn)為，糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)的發(fā)生是以高血糖或血脂代謝紊亂為啟動(dòng)因素，誘導(dǎo)各種血管活性物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞介質(zhì)、化學(xué)趨化因子、酶和蛋白質(zhì)等多種因素綜合作用所致，引發(fā)腎臟發(fā)生一系列病理變化，包括腎臟肥大、腎小球基底膜和腎小管基底膜增厚，以及腎小球系膜區(qū)ECM進(jìn)行性積聚，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，并出現(xiàn)蛋白尿、腎功能衰竭等[1-2]。本研究通過(guò)觀(guān)察絲膠對(duì)DN大鼠腎臟色素上皮衍生因子(pigment epthelium-derived factor,PEDF)表達(dá)的變化，探討絲膠保護(hù)糖尿病(diabetes mellitus,DM)腎臟損傷的作用，為臨床治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào):712024)。大鼠隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、模型組、絲膠治療組和絲膠預(yù)防組，每組12只。模型組、絲膠治療組和絲膠預(yù)防組大鼠均采用2% STZ(25mg/kg,3d)連續(xù)腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型，以血糖≥16.7mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。待模型成功建立后，模型組大鼠不再作任何處理;絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d)灌胃，連續(xù)35天;絲膠預(yù)防組大鼠于注射STZ前給予同等劑量絲膠灌胃35天。

1.2 藥物與試劑 STZ購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，臨用時(shí)用pH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液。絲膠由彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過(guò)濾、濃縮而成，彩色蠶繭由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。血糖檢測(cè)試劑盒，保定長(zhǎng)城臨床試劑有限公司;兔抗PEDF抗體，武漢博士德生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白定量試劑盒，北京泰格美科技有限公司。

1.3 檢測(cè)血糖 各組大鼠禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，3000r/min離心20min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖。

1.4 腎臟PEDF蛋白表達(dá)的檢測(cè) 各組大鼠取血后斷頭處死，迅速取雙側(cè)腎臟，一側(cè)腎臟入液氮保存，用于Western Blotting檢測(cè);另一側(cè)腎臟入Bounins液固定，用于免疫組化檢測(cè)。

1.4.1 免疫組化染色及定量分析:入Bounins液固定腎臟，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。采用SP免疫組織化學(xué)染色法觀(guān)察腎臟PEDF蛋白的表達(dá)。一抗為兔抗，稀釋濃度為1:50，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行定量分析:PEDF陽(yáng)性切片在10×40倍顯微鏡下選取視野，計(jì)算陽(yáng)性產(chǎn)物面積占整個(gè)視野面積的百分比。每只動(dòng)物任選3張切片，每張切片選取3個(gè)視野，取平均值。

1.4.2 Western Blotting檢測(cè)及定量分析:取200mg腎臟組織，提取蛋白，以BCA蛋白試劑盒定量蛋白濃度。采用Western Blotting法檢測(cè)大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá)，蛋白上樣量為60μg。12% SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜;一抗稀釋濃度為1:200，4℃過(guò)夜;Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。采用Quantiy One軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析，以PEDF條帶與β-actin條帶的灰度比值作為PEDF蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的血糖明顯升高(P＜0.01)。絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠的血糖明顯低于模型組(P＜0.01)。見(jiàn)附表。

2.2 各組大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果:PEDF免疫陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，位于腎小管上皮細(xì)胞胞漿;Western Blotting結(jié)果:在蛋白Marker的50KD水平處，可見(jiàn)PEDF蛋白條帶;在蛋白Marker的43KD水平處，可見(jiàn)β-actin條帶。與正常對(duì)照組大鼠相比，模型大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá)明顯下降(P＜0.01);絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá)明顯高于模型大鼠(P＜0.01)。見(jiàn)附表。

附表 各組大鼠血糖和腎臟PEDF蛋白的表達(dá)(±s)

附表 各組大鼠血糖和腎臟PEDF蛋白的表達(dá)(±s)

與正常對(duì)照組比較:*P＜0.01，與模型組比較:#P＜0.01

組別 血糖(mmol/L) 腎臟PEDF蛋白表達(dá)免疫組化法 Western Blotting法正常對(duì)照組 10.83±2.03 0.0193±0.0042 0.4013±0.050模型組 29.45±4.82* 0.0114±0.0025* 0.3385±0.014*絲膠治療組 13.20±4.09＃ 0.0155±0.0023＃ 0.3915±0.058＃絲膠預(yù)防組 11.04±2.29＃ 0.0163±0.0030＃ 0.3942±0.058＃

3 討論

DN是DM常見(jiàn)的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，是引起慢性腎功能不全進(jìn)而導(dǎo)致透析治療或腎臟移植的重要病因之一。DN在DM人群中的發(fā)生率為20-40%，伴有終末期DN的患者5年生存率小于20%[3]。目前治療DM多采用一些化學(xué)合成的藥物，如二甲雙胍、西他列汀、拜糖平等，雖然療效可靠但副作用較大。即使是公認(rèn)的經(jīng)典首選藥物—雙胍類(lèi)，在降低血糖的同時(shí)，易引起乳酸性酸中毒，死亡率較高[4]。正是這些毒副作用促使我們尋找一種降糖療效可靠且毒副作用無(wú)或極少的治療DM的新藥物，因此我們選擇了絲膠。

起源于我國(guó)的蠶絲業(yè)擁有幾千年的悠久歷史，但對(duì)蠶絲的應(yīng)用主要集中于絲素方面，絲膠約占繭絲的30%，在繅絲和精練時(shí)極大部分作為廢料而遭到遺棄[5]。絲膠是蠶絲中包被在絲素外圍的高分子水溶性蛋白，除含少量蠟質(zhì)、碳水化合物、色素和無(wú)機(jī)成分外，主要成分為絲膠蛋白;絲膠蛋白由18種氨基酸組成，含有較多的絲氨酸、天門(mén)冬氨酸和甘氨酸，其中7%左右是人體的必需氨基酸[6-7]。民間有蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方，本課題組的前期研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)[8]。

PEDF屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(SER-PIN)基因家族，廣泛分布于全身許多組織器官，在腎臟主要分布于腎小管上皮細(xì)胞和腎小管間質(zhì)，只有少量分布于腎小球[9]。PEDF在DN的發(fā)病中是一種保護(hù)性因素，它可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，降低腎小球毛細(xì)血管通透性，減少蛋白尿的排出，但PEDF抑制新生血管形成的機(jī)制目前尚不十分明確[10-11]。Stellmach等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，人血管內(nèi)皮細(xì)胞易受微環(huán)境的影響，培養(yǎng)液中內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)目隨PEDF劑量的增加而增加;因此推測(cè)，PEDF可能通過(guò)促進(jìn)活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、使血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺氧誘發(fā)的新生血管形成的信號(hào)無(wú)反應(yīng)來(lái)抑制新生血管形成。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎臟PEDF的表達(dá)明顯下降，加上對(duì)VEGF的抑制作用減弱，使腎小球毛細(xì)血管通透性增加及新生血管生成，從而導(dǎo)致蛋白尿及腎臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積，造成腎臟損害。

本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá)明顯高于糖尿病模型組大鼠。表明，絲膠可通過(guò)上調(diào)腎臟PEDF蛋白的表達(dá)，降低腎小球毛細(xì)血管的通透性及減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積，發(fā)揮保護(hù)糖尿病腎臟損傷的作用;同時(shí)，絲膠預(yù)處理可以阻止糖尿病腎臟損傷的發(fā)生，具有良好的預(yù)防保護(hù)作用。

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