劉海霞，李 鴻，蘇本利

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧大連 116027)

強(qiáng)力霉素對糖尿病小鼠肌肉轉(zhuǎn)染人胰島素基因的調(diào)控作用

劉海霞，李 鴻，蘇本利

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧大連 116027)

［目的］研究強(qiáng)力霉素對糖尿病小鼠肌肉轉(zhuǎn)染人胰島素基因表達(dá)的調(diào)控作用。［方法］構(gòu)建prTA-tet4-rhINS質(zhì)粒;以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)昆明小鼠成糖尿病模型。采用電穿孔法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS，通過強(qiáng)力霉素(doxcycline，Dox)水給藥/撤除以評價(jià)四環(huán)素系統(tǒng)調(diào)控人胰島素表達(dá)的可行性。檢測末梢血糖，血清人真胰島素及小鼠肌肉組織人胰島素原基因mRNA表達(dá)情況。［結(jié)果］電穿孔轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒胰島素后，立即予飲Dox水，可在小鼠肌肉組織中檢測到mRNA表達(dá)，第2周降糖效果最佳，撤除強(qiáng)力霉素后，血糖回升，于48 h升至轉(zhuǎn)染前水平，再次予飲Dox水后，血糖逐漸下降，72 h內(nèi)達(dá)到撤藥前水平。重復(fù)給藥/撤藥兩次結(jié)果一致。［結(jié)論］通過給藥/撤除Dox可以實(shí)現(xiàn)對人胰島素原基因表達(dá)的開關(guān)調(diào)控。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng);胰島素;糖尿病;基因治療

1型糖尿病的病因?yàn)轶w內(nèi)胰島素絕對缺乏，故患者須終生應(yīng)用胰島素?；蛑委熖悄虿∈冀K為研究熱點(diǎn)，它是將胰島素基因直接導(dǎo)入患者體內(nèi)，長期產(chǎn)生有生物活性的胰島素。胰島素如產(chǎn)生過量勢必有發(fā)生低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，因此，胰島素基因的表達(dá)調(diào)控則是基因治療成功的基本保障。四環(huán)素(tetracycline，Tet)調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展的人類基因治療中可接受的一種表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)［1］。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建可由四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素調(diào)控的人胰島素原基因(prTA-tet4-rhINS)表達(dá)載體，研究基因?qū)牒笠葝u素基因在糖尿病小鼠骨骼肌中的表達(dá)水平及活性，通過糖尿病小鼠飲用水中強(qiáng)力霉素(doxcycline，Dox)的給藥/撤除以評價(jià)四環(huán)素系統(tǒng)中的Tet-on系統(tǒng)對人胰島素基因表達(dá)的開關(guān)、調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑:質(zhì)粒 pLNCX購自美國 Clontech公司，pINS-ABC(帶有furin酶切位點(diǎn)的重組人胰島素原基因)［2］由西班牙巴塞羅那大學(xué)獸醫(yī)院Fatima Bosch教授惠贈，pUHG102-8、pUHrT2-1(四環(huán)素抗性基因操縱子系統(tǒng))［3］由德國Heidelberg大學(xué)H.Bujard教授惠贈。鏈脲佐菌素(STZ)、強(qiáng)力霉素(doxcycline)及DEPC水均購自sigma公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。RT-PCR所用引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。DL-2000，λ-HindⅢ分子量標(biāo)準(zhǔn)購自寶生物工程(大連)有限公司。人胰島素ELISA試劑盒購自美國BIOSOURCE公司，敏感度為0.15 μIU/mL，與人胰島素的交叉反應(yīng)為100%，與人胰島素原及大鼠胰島素的交叉反應(yīng)為0%。

1.1.2 主要器材:血糖儀及試紙(葡萄糖氧化酶法，美國羅氏公司)，DNA擴(kuò)增儀(美國PE公司)，TS-B轉(zhuǎn)基因儀(北京醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo Labsystems公司)，M-26型紫外光透照儀(美國)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物:昆明種小鼠150只，雄性，8～10周齡，體重(28±2)g購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)經(jīng)過大連醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2 方 法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建，擴(kuò)增和提取:pINS-ABC帶有furin酶切位點(diǎn)的重組人胰島素原基因，能夠在成肌細(xì)胞成熟為胰島素，通過基因重組將重組人胰島素原基因構(gòu)建為prTA-tet4-rhINS，電轉(zhuǎn)至感受態(tài)大腸桿菌JM109中，堿裂解法提取質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法進(jìn)行純化，并對插入的rhINS片段進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和直接測序［4］。

1.2.2 糖尿病小鼠模型的建立及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染:150只昆明小鼠，每只小鼠以120 mg/kg腹腔注射新鮮配制的1.5%STZ溶液(pH 4.1)。5 d后檢測隨機(jī)鼠尾末梢血糖≥16.67 mmol/L為成模，篩選血糖穩(wěn)定在26～32 mmol/L達(dá)2周者留做實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)小鼠分兩組，第1組小鼠(42只)的兩側(cè)股部肌肉各注射質(zhì)粒 prtTA -tet-INS 150 μg(總計(jì)300 μg)，轉(zhuǎn)染后立即喂?jié)舛葹? mg/mL Dox水(簡稱Dox組);第2組小鼠(35只)的兩側(cè)股部肌肉各注射質(zhì)粒prtTA-tet-INS 150 μg(總計(jì) 300 μg)，轉(zhuǎn)染后飲用水中無Dox(簡稱no Dox組)。第1、2組質(zhì)粒注射后5 min內(nèi)在注射部位兩側(cè)與注射平行方向插入兩根電極針(直徑0.2 mm，長度1.5 cm，兩針間距0.5 cm)并將其與轉(zhuǎn)基因儀連接，給予方波電脈沖刺激(電壓200 V/cm，波寬 40 ms，脈沖次數(shù) 6 和頻率 1 Hz)［5，6］。兩組轉(zhuǎn)染后監(jiān)測鼠尾末梢血糖。

1.2.3 動物標(biāo)本的留取及檢測:轉(zhuǎn)染第14天，各組各取3～4只小鼠，摘眼球取血，分離血清，保存于-20℃冰箱中;留取兩股肌肉、肝臟組織，保存于液氮中。

1.2.4 小鼠血清人胰島素:按廠家提供說明書ELISA法檢測小鼠血清人胰島素。

1.2.5 小鼠肌肉組織中人胰島素原基因mRNA的提取及RT-PCR檢測:按廠家提供的方法用Trizol試劑提取肌肉、肝臟組織mRNA。以小鼠β-actin為內(nèi)參，上游引物:5＇- AGCCTTCCTTCTTGGGTATG -3＇，下游引物:5＇- AACGCAGCTCAGTAACAGTC -3＇，擴(kuò)增片段長度為364 bp。根據(jù)質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS的rhINS片段設(shè)計(jì)引物，上游引物:5＇-CGCAGCCTTTGTCAACCAAC -3＇，下游 引 物:5＇- CACAATGCCACGCTTCTGTC -3＇，擴(kuò)增片段長度為217 bp。RT -PCR反應(yīng)條件:30℃，10 min;42℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min;1個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)條件:94℃，2 min;1個(gè)循環(huán);94 ℃，30 s;55 ℃，30 s;72 ℃，1 min;共35個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，t檢驗(yàn)進(jìn)行組間均值比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人胰島素原基因在小鼠肌肉組織中的表達(dá)

Dox組與no Dox組轉(zhuǎn)移后通過RT-PCR在肌肉組織均得到預(yù)期的217 bp人胰島素原基因mRNA條帶，且前者在亮度上顯著強(qiáng)于后者(圖1A)，證實(shí)載有Tet-on系統(tǒng)的人胰島素原基因經(jīng)Dox調(diào)控后在小鼠肌肉組織中具有較高水平的mRNA表達(dá)，當(dāng)無Dox調(diào)控時(shí)，同樣可以檢測出較低水平的表達(dá)。而兩組肝臟組織的RT-PCR未擴(kuò)增出特異條帶(圖1A)。

圖1 人胰島素原基因在小鼠肌肉組織中的表達(dá)Fig 1 mRNA RT-PCR results

2.2 兩組小鼠血清人胰島素比較

Dox組轉(zhuǎn)移prTA-tet4-rhINS質(zhì)粒之后糖尿病小鼠血清中人胰島素水平明顯增高，為(55.67±1.366)μIU/L，no Dox組也可檢測到糖尿病小鼠血清胰島素，但水平較低(16.3 ±0.577)μIU/L，兩組比較差異有顯著性意義，P＜0.01。

2.3 強(qiáng)力霉素對prTA-tet4-rhINS基因表達(dá)的調(diào)控

電穿孔轉(zhuǎn)移人胰島素原基因后，no Dox組雖然血清中可檢測到人胰島素，但并無明顯降糖作用，電轉(zhuǎn)移24 h后，Dox組與no Dox組小鼠的血糖比較差異有顯著性意義，P＜0.05，可實(shí)現(xiàn)較為明顯的降糖效果;撤除Dox組飲用水中的Dox后，糖尿病小鼠體內(nèi)血糖開始升高，于48 h后升至治療前血糖水平，此時(shí)兩組比較血糖差異無顯著性意義，P＞0.05;再次給入Dox，血糖水平逐漸下降，并于72 h內(nèi)達(dá)到撤藥前水平，Dox組與no Dox組小鼠的血糖比較差異有顯著性意義，P＜0.05。見圖2。

3 討 論

圖2 兩組糖尿病小鼠電轉(zhuǎn)后血糖水平及調(diào)控作用Fig 2 Comparison of the hypoglycemic effect in the Dox and no Dox group and tetracycline regulation on human proinsulin expression

鑒于生理情況下，胰島素的分泌是受葡萄糖調(diào)節(jié)感受器調(diào)控的，而導(dǎo)入體內(nèi)的胰島素基因的持續(xù)表達(dá)勢必會存在低血糖的危險(xiǎn)，故胰島素基因的調(diào)控表達(dá)則成為基因治療的關(guān)鍵，本研究從此方面進(jìn)行了探索。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)是一種反式作用因子調(diào)控模式，于1992年首先由Gossen和Bujard構(gòu)建成功。反式作用因子tTA/rtTA為一融合蛋白，兩者僅相差4個(gè)氨基酸，分別組成四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的兩種形式:tetoff和tet-on系統(tǒng)。tet-on系統(tǒng)中，四環(huán)素的存在使rtTA發(fā)生構(gòu)象變化，從而與四環(huán)素啟動子(Ptet)中的四環(huán)素操縱子(tetO)相結(jié)合使轉(zhuǎn)錄發(fā)生;而在tet-off系統(tǒng)中，加入四環(huán)素則使tTA與 Ptet分離，從而使轉(zhuǎn)錄中斷。本實(shí)驗(yàn)采用的是tet-on系統(tǒng)，通過加入/撤除強(qiáng)力霉素(四環(huán)素的衍生物)，rtTA2-1特異、可逆地與Ptet結(jié)合、分離，從而作為一種轉(zhuǎn)錄開關(guān)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，為增加表達(dá)效率，在Ptet與Ph-CMV兩啟動子之間插入一段3.3 kbp序列，以使兩者互不干擾發(fā)揮最大作用。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的突出特點(diǎn)為:可產(chǎn)生階梯式、漸進(jìn)性調(diào)控。另外，它來源于原核生物，不干擾真核生物基因組的表達(dá)，同時(shí)其誘導(dǎo)物強(qiáng)力霉素(Dox)劑量相當(dāng)于其毒性劑量的1/300，故較為安全。目前，四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)已成功調(diào)控了多種基因的表達(dá)［7-9］，其安全、高效的特點(diǎn)已得到公認(rèn)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)載有Tet-on系統(tǒng)的人胰島素原基因經(jīng)強(qiáng)力霉素(Dox)調(diào)控后在小鼠肌肉組織中具有較高水平的mRNA表達(dá)。當(dāng)無Dox調(diào)控時(shí)，同樣可以檢測出較低水平的表達(dá)，說明該系統(tǒng)存在背景表達(dá)。而兩組肝臟組織的RT-PCR未擴(kuò)增出特異條帶，說明人胰島素原基因僅在注射部位的肌肉組織中特異表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染載有Tet-on系統(tǒng)的人胰島素原基因?qū)崿F(xiàn)了該基因的表達(dá)，通過飲用水中加入Dox，獲得了較為理想的降糖效果，同時(shí)撤除Dox后，糖尿病小鼠體內(nèi)血糖開始升高，于48 h后升至治療前血糖水平，再次給入Dox，血糖水平逐漸下降，并于72 h內(nèi)達(dá)到撤藥前水平。如此重復(fù)加入/撤除兩次均能實(shí)現(xiàn)對質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS的表達(dá)開關(guān)，從而達(dá)到安全調(diào)控的目的。而飲用水中未加入調(diào)控誘導(dǎo)劑Dox時(shí)，在肌肉組織中可以檢測到較低水平的人胰島素基因mRNA水平表達(dá)，且血清中可檢測到較低水平的人胰島素，但此胰島素水平并不能使糖尿病小鼠血糖降低，據(jù)此可推斷，Teton系統(tǒng)對于調(diào)控基因的背景表達(dá)或許可為糖尿病小鼠提供較為安全平穩(wěn)的基礎(chǔ)胰島素分泌，這恰恰為胰島素基因治療糖尿病要求非進(jìn)餐時(shí)體內(nèi)存在低水平的基礎(chǔ)胰島素，而餐后較高水平表達(dá)控制餐后血糖所需要的，但應(yīng)該看到本研究Dox調(diào)控雖然可以通過給藥與撤除強(qiáng)力霉素實(shí)現(xiàn)對prTA-tet4-rhINS質(zhì)粒的表達(dá)開關(guān)，從而使血糖隨其升降，但胰島素基因表達(dá)以及血糖的升降滯后于給藥撤藥的時(shí)間過長，如何實(shí)現(xiàn)該基因體內(nèi)表達(dá)的瞬時(shí)調(diào)控需進(jìn)一步深入研究。

本實(shí)驗(yàn)在胰島素基因治療的調(diào)控方面做一嘗試，結(jié)果表明強(qiáng)力霉素調(diào)控的胰島素基因可實(shí)現(xiàn)糖尿病小鼠體內(nèi)穩(wěn)定的表達(dá)，產(chǎn)生明顯的降糖效果，且僅通過飲用水中誘導(dǎo)劑的加入撤除，即可實(shí)現(xiàn)該基因的開關(guān)表達(dá)，重復(fù)性好，操作簡便、安全，為分泌蛋白的人為體內(nèi)調(diào)控的可行性提供了依據(jù)。

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［1］Wildon M O，Svouhsll K T，Rsysnsmsty J，et al.Tetracy -cline-regulated secretion of human(pro)insulin following plasmid - mediated transfection of human muscle［J］.J Mol Endocinol，2005，34(2):391 -403.

［2］Gros L，Riu E，Montoliu L，et al.Regulated production of mature insulin by non - beta - cells［J］.Hum Gene Ther，1997，10(7):2249 -2259.

［3］Baron U，Schnappinger D，Helbl V，et al.Generation of conditional mutants in higher eukaryotes by switching between the expression of two genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(3):1013 -1018.

［4］李鴻，蘇本利，劉海霞，等.肌肉注射可調(diào)控胰島素基因?qū)μ悄虿⌒∈蠼堤亲饔茫跩］.生物物理與生物化學(xué)進(jìn)展，2004，31(2):278 -281.

［5］張國華，沈冬，金采科，等.電脈沖介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移效率的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，1(81):937-940.

［6］Jaichandran S，Yap ST，Khoo AB，et al.In vivo liver electroporation:optimization and demonstration of therapeutic efficacy［J］.Hum Gene Ther，2006，17(3):362 -375.

［7］Reboredo M，Kramer MG，Smerdou C，et al.Transcriptomic Effects of Tet-On and Mifepristone-Inducible Systems in Mouse Liver［J］.Hum Gene Ther，2008，19(11):1233 -1248.

［8］Seo E，Kim S，Jho EH.Induction of cancer cell- specific death via MMP2 promoterdependent Bax expression［J］.BMB Rep，2009，42(4):217 -222.

［9］Hojman P，Gissel H，Gehl J.Sensitive and precise regulation of haemoglobin after gene transfer of erythropoietin to muscle tissue using electroporation［J］.Gene Ther，2007，14(12):950-959.

Regulated human proinsulin expression in vivo using Tet-inducible vectors

LIU Hai- xia，LI Hong，SU Ben - li
(Department of Endocrinology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China)

Abstract:［Objective］To evaluate the hypoglycemic effect of a doxycycline regulated insulin expression vector electroporated to skeletal muscle of streptozotocin-induced diabetic mice.［Methods］The plasmid prTA -tet4-rhINS constructed previously was transferred to hindleg muscle of streptozotocin - induced diabetic mice of Kunming species，and fed in the drinking water with doxycycline immediately.The tail blood glucose was measured with glucose oxidase method daily.Human true insulin was analyzed with ELISA.Total mRNA were extracted from muscles and liver tissues.RT - PCR was used to analyze the human proinsulin mRNA levels.［Results］Following intramuscular injection of the vector，the insulin mRNA expressions in mice muscles were examined and repeated induction of serum insulin protrein following doxycycline administration were observed.The best hypoglycemic effect was showed in second week after transfer，with withdrawal of inducer doxycycline，blood glucose began to increase to the level before transfer in 48 hours;and then with doxycycline administration，blood glucose of the mice decreased to the level gradully before withdrawal in 72 hours.Two cycles of regulation with the same results were achieved over 34 days.［Conclusion］The tet- on system is a useful tool for controlling the expression of human insulin electropotated in mice.

Key words:tetracycline regulatory system;insulin;diabetes mellitus;gene therapy

Q78

A

1671-7295(2011)05-0444-04

2011-04-14;

2011-05-29

劉海霞(1977-)，女，黑龍江雞西人，主治醫(yī)師，博士研究生。E-mail:dllhx1017@163.com

蘇本利，教授。E-mail:dlbenlisu@sina.com