李 敏，張艷賞，張明明，閆 萍

已有研究表明卵巢癌組織中有促性腺激素釋放激素 (Gn-RH)Ⅰ、GnRHⅡ及其受體的表達(dá)［1］，顯示人卵巢癌細(xì)胞具有合成和分泌GnRH的功能。目前國內(nèi)關(guān)于GnRH激動劑對卵巢癌細(xì)胞系作用的報道較少，本研究以GnRH受體陽性的人卵巢低分化漿液性乳頭狀癌細(xì)胞株OVCAR3為研究對象，使用Gn-RH激動劑曲普瑞林作用于OVCAR3細(xì)胞，觀察其在體外水平對卵巢癌細(xì)胞生長的抑制作用及對GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的影響，初步探討曲普瑞林抗腫瘤作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人卵巢低分化漿液性乳頭狀癌細(xì)胞株OVCAR3由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心保存。

1.2 實驗儀器 相差顯微鏡 (LH50A型，日本OLYMPUS公司)，低溫超速離心機(jī) (UNIVERSAL－30RF型，德國Hettich公司)，－80℃超速低溫冰箱 (MDF－382型，日本SANYO公司)，－152℃超低溫冰柜 (MDF－1152 ATN型，日本SANYO公司)，紫外分光光度計 (756型，上海光學(xué)儀器廠)，PCR儀 (GeneAmp 9600型，美國PE珀金－埃爾默公司)，高速低溫離心機(jī) (RS－28型，德國Hettich公司)，UVP凝膠掃描系統(tǒng) (GelDoc－It TS型，美國UVP公司)，雙恒定時電泳儀 (DYZ－22A型，北京市六一儀器廠)，橋式電泳儀 (DYY－Ⅲ型，北京市六一儀器廠)。

1.3 主要試劑 RPMI－1640干粉 (美國GIBCO公司)，胎牛血清 (美國 GIBCO公司)，胰蛋白酶 (美國 Sigma公司)。MTT粉 (Sigma公司)，DMSO試劑 (成都化學(xué)試劑廠)，曲普瑞林 (輝凌制藥生產(chǎn)，由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖中心提供)RT－PCR使用的試劑:Trizol Reagent(為Invitrogen公司產(chǎn)品)，氯仿，異丙醇，焦磷酸二乙酯DEPC(天根生化科技有限責(zé)任公司)，反轉(zhuǎn)錄酶 (AMV－RT，美國Promega公司)，核糖核酸酶抑制劑 (RNase Inhibitor，美國 Promega公司)，dNTP mix(美國 Promega公司)，PCR mix(美國 Promega公司)，隨機(jī)引物 (Random primers，美國Promega公司)，瓊脂糖 (agarose，美國Promega公司)，Oligo dT 15(北京天根生化科技有限責(zé)任公司提供)，DNA Marker－D(北京賽百盛基因技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇:從－152℃超速低溫冰箱里取出所用腫瘤細(xì)胞的凍存管，放入37℃水浴箱中迅速解凍，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)基洗兩遍，移至培養(yǎng)瓶中，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。腫瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，1～2 d換液1次。消化傳代:貼壁細(xì)胞鋪滿90%以上時需要傳代，加入消化液適量，倒置顯微鏡下觀察，看見細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間隙變大時棄去消化液，加入適量的培養(yǎng)基，吸管吹打成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min，離心5 min;棄上清，加培養(yǎng)液，分至2～3個培養(yǎng)瓶，放置于37℃、5%CO2條件下，1～2 d換液1次。細(xì)胞計數(shù):用95%乙醇洗凈計數(shù)板，擦干，取干凈蓋玻片覆于計數(shù)板上，將細(xì)胞懸液于一側(cè)滴加到蓋玻片中，在顯微鏡下用10倍物鏡觀察計數(shù)四角大方格中的細(xì)胞數(shù)，計算計數(shù)盤周邊四大格的細(xì)胞數(shù)，壓線者僅計數(shù)左側(cè)及上方。有2個以上細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)按單個細(xì)胞計算，細(xì)胞團(tuán)占10%以上時說明分散不充分，應(yīng)重新制備細(xì)胞懸液后再進(jìn)行計算。帶入下式得出每毫升原液中的細(xì)胞數(shù):細(xì)胞數(shù)/ml=(4大格細(xì)胞總數(shù)/4) ×104×稀釋倍數(shù)，根據(jù)細(xì)胞總數(shù)決定如何稀釋成所需要的細(xì)胞濃度。

1.4.2 MTT法測細(xì)胞抑制率

1.4.2.1 實驗分組 卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系OVCAR3表達(dá)2種GnRH受體［2］，故采用OVCAR3細(xì)胞來檢測促性腺激素釋放激素類似物 (GnRH－a)對細(xì)胞生長的影響。將6種濃度的 GnRH－a，即 10－2mol/L，10－3mol/l，10－4mol/L，10－5mol/L，10－6mol/L及10－7mol/L的GnRH－a作用于細(xì)胞影響其生長，時間分別為24 h，設(shè)5個復(fù)孔，找出最適濃度;對細(xì)胞生長抑制率最高的濃度作用24 h、48 h、72 h，比較最適作用時間。

1.4.2.2 操作步驟 收集對數(shù)期的人卵巢癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的1640調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入180 μl，約計細(xì)胞1×103個，96孔板周邊各孔不加細(xì)胞僅用培養(yǎng)液填充。本實驗共設(shè)置6個GnRH－a濃度處理組，濃度范圍10－7mol/L～10－2mol/L。5%CO2、37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底 (96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物，濃度分別為 10－1mol/L、10－2mol/L、10－3mol/L、10－4mol/L、10－5mol/L 和10－6mol/L，每孔20 μl，設(shè)5 個復(fù)孔。生存對照孔則加0.9%氯化鈉溶液20 μl。5%CO2、37℃孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μl MTT溶液 (5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入150 μlDMSD，置脫色搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值 (OD)。每次樣本測定均在30 min內(nèi)完成，實驗重復(fù)3次。根據(jù)以上做出的劑量－效應(yīng)關(guān)系，選擇一個最佳GnRH－a劑量進(jìn)行時間－效應(yīng)關(guān)系的觀察，在用藥后24 h、48 h、72 h進(jìn)行MTT檢測，具體方法同上。細(xì)胞抑制率=1－(OD實驗組/OD對照組) ×100%。

1.5 GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的測定

1.5.1 RT－PCR檢測GnRHⅠ受體、GnRHⅡ受體的表達(dá)

1.5.1.1 主要試劑的配制 GnRH－a藥物的配制:將藥物用0.9%的氯化鈉溶液溶解，配制成為10－3mol/L、10－4mol/L和10－5mol/L。

1.5.1.2 目的基因的合成 GAPDH上游引物:5'－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3'，下游引物:5'－TCCACCACCCTGTTGCTG－3'。GnRHⅠ受體上游引物:5'－GAAAAGCAACAGCAAAGTCGG－3'，下游引物:5'－AGGGAGTCCAGCAGACAGTA－3'。GnRHⅡ受體上游引物:5'－GGACTTAGTTTCCTGCTTGCC－3'，下游引物:5'－GATGGCTGGGTCAAATGGTATT－3'，引物序列依據(jù)文獻(xiàn)報道設(shè)計，由上海生物工程公司合成。

1.5.1.3 實驗分組 將細(xì)胞分為對照組和實驗組，第1組為對照組，不加藥物;第2、3、4、5、6、7組為實驗組，為加藥物的細(xì)胞，濃度為 10－6mol/L、10－5mol/L和 10－4mol/L，分別培養(yǎng)24 h(2、3、4組)和48 h(5、6、7組);收集細(xì)胞檢測GnRHⅠ受體、GnRHⅡ受體的表達(dá)，并進(jìn)行比較。

1.5.2 RT－PCR的實驗步驟

1.5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 收集對數(shù)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，使用6孔板，每孔加入5×105個細(xì)胞，加新的培養(yǎng)基270 μl。在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞完全貼壁后加藥，每孔30 μl，濃度為10－4mol/L、10－5mol/L和10－6mol/L，有一對照孔不加藥。置于5%CO2、37℃孵育24 h、48 h。每個樣品重復(fù)5組。

1.5.2.2 提取RNA 收集細(xì)胞，倒去培養(yǎng)基，用PBS液沖洗3遍，每孔細(xì)胞加1 ml的Trizol，用槍頭反復(fù)吹打使細(xì)胞完全裂解，加入200 μl氯仿，劇烈振蕩混勻30 s，在臺式離心機(jī)上，12 000 r/min，4℃離心20 min。將上清液小心轉(zhuǎn)移到Rnase－free的1.5 ml離心管里，加入等體積的異丙醇，－20℃下放置過夜。臺式離心機(jī)上12 000 r/min，4℃離心20 min，棄去上清液，用70%乙醇洗滌2次，每次900 μl，12 000 r/min，4℃離心5 min。干燥3～5 min，沉淀用20 μl DEPCH2O溶解。

1.5.2.3 提取RNA的完整性檢測 將RNA提取液4 μl與上樣緩沖液2 μl混合，1%瓊脂糖凝膠 (含EB)，電泳緩沖液1×TBE，120 V電泳5 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.5.2.4 提取RNA的定量 用756型紫外分光光度計測量OD260/OD280比值，可檢測RNA的純度和含量，選用OD260/OD280比值為1.8～2.0的RNA用作反轉(zhuǎn)錄。

1.5.2.5 cDNA第一鏈合成 第一步:加入RNA原液3 μl，Oligo dT 15 1 μl，Nucleasr－Free Water 6 μl，共10 μl反應(yīng)液，70℃水浴10 min后，迅速置于冰上。第二步:加入5×R.T.buffer×5 μl，dNTP 1 μl(原液 10 M)，RNasin 1 μl(原液20 U)，M－MLV 1 μl(原液 5 U)Nucleasr－Free Water 7 μl，共15 μl反應(yīng)液。42℃反應(yīng)3 h后－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2.6 PCR 配置PCR反應(yīng)液完成后放入PCR儀，擴(kuò)增條件94℃ 1 min，55℃45 s，72℃ 45s(5個循環(huán))，在進(jìn)行94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min(25個循環(huán))，72℃ 延伸10 min。

1.5.2.7 RT－PCR產(chǎn)物半定量 取RT－PCR產(chǎn)物8 μl，加上樣緩沖液2 μl，在1%瓊脂糖凝膠 (含EB)上電泳，120 V，10 min，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝并打印實驗結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng) (Gel－Pro Analyzer Version 3.0)分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用 (±s)表示，所得結(jié)果行方差齊性檢驗、單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曲普瑞林對卵巢癌細(xì)胞OVCAR3生長的影響 MTT測定結(jié)果，10－7mol/L濃度的曲普瑞林作用細(xì)胞24 h后，其細(xì)胞抑制率為 (41.07±0.43)%，隨著濃度梯度的不斷增高，10－6mol/L、10－5mol/L、10－4mol/L、10－3mol/L、10－2mol/L 細(xì)胞抑制率分別為 (50.56±0.76)%、(69.86±1.05)%、(65.43±0.87)%、(62.09±1.24)%、(58.69±0.87)%;10－5mol/L濃度的曲普瑞林抑制率最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);以10－5mol/L濃度的曲普瑞林作用于細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞抑制率分別是 (69.86±1.08)%、 (58.69±0.98)%、(48.56±1.02)%，最終是作用時間在24 h時細(xì)胞的抑制率最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見圖1)。

2.2 GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的表達(dá) RT－PCR測定曲普瑞林作用于細(xì)胞后，GnRHⅠ受體的表達(dá):10－6mol/L、10－5mol/L、10－4mol/L曲普瑞林作用于 OVCAR3 24 h時，10－5mol/L GnRHⅠ受體表達(dá)高。10－5mol/L曲普瑞林作用于OVCAR3 24 h時較48 h時GnRHⅠ受體表達(dá)增高 (見圖2)。GnRHⅡ 受體的表達(dá):10－6mol/L 、10－5mol/L、10－4mol/L曲普瑞林作用于 OVCAR3 24 h時，在10－5mol/L GnRHⅡ受體表達(dá)高，10－5mol/L曲普瑞林作用于OVCAR3 24 h時較48 h時GnRHⅡ受體表達(dá)量高 (見圖3)。

圖1 不同濃度曲普瑞林作用24 h GnRHⅠ受體電泳圖Figure1 Electropherogram of PCR product of GnRHⅠR and GAPDH;Compared with expressions of GnRHⅠR between different groups

圖2 10－5mol/L相同濃度曲普瑞林作用不同時間GnRHⅠ受體表達(dá)Figure2 Electropherogram of PCR product of GnRHⅠR and GAPDH;Compared with expressions of GnRHⅠR between different groups

圖3 10－5mol/L濃度曲普瑞林作用不同時間GnRHⅡ受體表達(dá)Figure3 Electropherogram of PCR product of GnRHⅡR and GAPDH;Compared with expressions of GnRHⅡR between different groups

3 討論

GnRH存在多種亞型，主要調(diào)節(jié)性腺內(nèi)受體形成和激素功能。已從脊椎動物和原索動物的神經(jīng)組織中分離出24種不同的GnRH，它們組成了一個神經(jīng)肽家族，研究顯示只有GnRHⅠ (哺乳動物GnRH)與GnRHⅡ (雞GnRH)基因出現(xiàn)在人類基因組。其相應(yīng)受體GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的基因也在人類基因組中被發(fā)現(xiàn)［3－4］。GnRH高表達(dá)于激素依賴性腫瘤，并對其生長發(fā)揮重要的調(diào)控作用?，F(xiàn)有研究表明GnRH及其受體不僅對生殖系統(tǒng)良性腫瘤有調(diào)節(jié)作用，而且對生殖系統(tǒng)惡性腫瘤也有同樣的作用。有證據(jù)表明GnRH－α對某些激素敏感的腫瘤具有直接抑制其癌細(xì)胞分裂增殖的作用［5］。GnRH－a能降低促性腺激素水平，因此，可以通過此種途徑起間接抗腫瘤作用。

常用的GnRH激動劑是人工合成的九肽類似物。如國產(chǎn)的LRH－A3和國外的Buserelin、Triptorelin等。Triptorelin即曲普瑞林。有資料表明曲普瑞林對多種腫瘤有一定的治療作用。Borroni等［6］所研究的GnRH拮抗劑醋酸亮丙瑞林抑制體外異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)藥物在10－9～10－5mol/L濃度時，有明顯的抗細(xì)胞增殖作用，而且在10－5mol/L濃度時，出現(xiàn)最大的抑制效應(yīng)。我們推測同樣作為性激素依賴性疾病的卵巢腫瘤應(yīng)用GnRH類似物治療會有一定意義。

國外研究表明，在卵巢癌及卵巢癌細(xì)胞株中有兩種形式GnRH及GnRHmRNA的存在［7－8］。因而認(rèn)為卵巢癌局部有Gn-RH自分泌系統(tǒng)的存在。GnRH－α對腫瘤的直接作用也可能存在于卵巢癌。近年來研究GnRH－α用于性激素依賴性疾病的治療表明，GnRH－α對表達(dá)GnRH受體的人前列腺癌細(xì)胞系生長有明顯抑制作用［9］。Emons等［10］進(jìn)行了Ⅱ期臨床試驗探討應(yīng)用GnRH激動劑AESZ－108靶向治療LHRH受體陽性的腫瘤的耐受劑量。Chianese等［11］研究顯示AEA一種GnRH拮抗劑也對林蛙GnRHⅠ、GnRHⅡ表達(dá)產(chǎn)生影響。

本實驗將不同濃度的曲普瑞林 (10－2～10－7mol/L)作用于卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)24 h，在低濃度10－7mol/L時即對細(xì)胞有抑制作用，且隨濃度的增高，在曲普瑞林為10－5mol/L時，抑制率最高，成時間－劑量依賴效應(yīng)。這與Borroni等［6］的實驗結(jié)果相一致，推測在運(yùn)用曲普瑞林治療卵巢癌的作用機(jī)制中，至少有部分是以旁分泌或自分泌形式作用于靶組織。研究結(jié)果顯示，GnRH激動劑對人OVCAR3細(xì)胞有顯著的抑制作用。

GnRHⅠ受體的表達(dá):RT－PCR測定不同濃度triptorelin作用于OVCAR3 48 h時，在10－5mol/L GnRHⅠ受體表達(dá)高。當(dāng)曲普瑞林濃度為10－5mol/L，作用24 h時細(xì)胞GnRHⅡ受體表達(dá)最高。GnRHⅡ受體的表達(dá)結(jié)果與GnRHⅠ受體相似。顯示GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的表達(dá)變化與抑制腫瘤細(xì)胞生長作用有關(guān)。但目前有關(guān)GnRH及其類似物抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不十分明確，國內(nèi)外研究仍無定論，還需要進(jìn)一步研究。

從本研究結(jié)果可以進(jìn)一步推測，在體外實驗中，GnRH激動劑曲普瑞林抑制GnRH受體陽性的人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，是通過首先激活GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的表達(dá)完成的，以上結(jié)果仍有待于體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實?？梢栽O(shè)想應(yīng)用GnRH－α及其他細(xì)胞毒性藥物制成聯(lián)合制劑，通過GnRH受體的介導(dǎo)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時殺死癌細(xì)胞，所以GnRH－α有可能成為治療人類卵巢癌的一種切實可行的新型抗腫瘤的生物制劑。這些研究將有助于為抗腫瘤新藥的研發(fā)提供依據(jù)。

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