談 唯 宋 捷 張潤桐 陳 斌 賈曉斌

江蘇省中醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇 南京 210000

冬蟲夏草 (Cordyceps sinensisBerk.Sacc)為重要的真菌營養(yǎng)源與藥源，具有扶正固本、補氣養(yǎng)血等功效，富含蟲草多糖、蟲素等多種生物活性物質(zhì)，系我國名貴傳統(tǒng)滋補強身藥材，有保肺、益腎、止血、化痰等功效，蛹蟲草(Cordyceps militaris(L.)Link)與冬蟲夏草同屬異種，有效成分的種類及含量接近，且人工培養(yǎng)較成功［2］。民間將全草應用于免疫增強和慢性支氣管炎平喘、腎虛等方面［3］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草可增強巨噬細胞的吞噬功能，具有抗菌、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等重要作用。目前在抗疲勞領域?qū)ζ淇蛊跈C制已進行深入研究，普遍認為蛹蟲草能夠通過調(diào)節(jié)機體能量消耗、代謝的紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能失調(diào)，起到抗疲勞的作用［1］。本實驗研究了復方蛹蟲草制劑，通過測量小鼠負重游泳持續(xù)時間、肝糖原，血清尿素氮，觀察該復方對小鼠抗疲勞作用的影響，通過測定耳腫脹度和碳廓清指數(shù)a來觀察該復方對小鼠免疫功能的影響，現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

藥物：復方蛹蟲草制劑由蛹蟲草、黃芪、黃精、紅參、陳皮、制何首烏、茯苓組成，均購自亳州市聯(lián)華醫(yī)藥有限公司。將處方量藥材投料，水煎煮3次，每次1小時，過濾，合并濾液，常壓濃縮，加95%乙醇沉淀至含醇量為30%，取上清液，回收乙醇后，得浸膏，加純化水混勻后灌胃給藥。

實驗動物和儀器：昆明種健康雄性小鼠，體重20±2g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXX(滬)2007-0005。主要儀器：XMTW-4100游泳箱 (北京碩林苑科技有限公司)、AR2140分析天平 (梅特勒托多儀器公司)、酶標儀、日立7020全自動生化儀 (日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 劑量與分組

負重游泳試驗，生化指標 (血清尿素氮、肝糖原)及免疫指標所用動物均隨機分成4組，每組12只，按給藥劑量分別為1.2、2.5、7.5g·kg-1(相當于人體推薦攝入量的5倍、10倍、30倍)分為低、中、高3個劑量組和1個對照組 (9.0 g/L氯化鈉注射液)。以灌胃方式給藥，1次/d，共 30 d。

1.2.2 負荷游泳時間測定

末次給予受試物30 min后，置小鼠于游泳箱中，水深35 cm，水溫 (25±1.0)℃，小鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮，記錄小鼠游泳開始至死亡的時間作為小鼠負重游泳時間。

1.2.3 血清尿素氮含量的測定

末次灌胃給予受試物30 min后，在溫度為30℃的水中不負重游泳90 min，摘眼球采血，2 000r·min-1離心15 min，取血清用日立7020全自動生化儀測定尿素氮含量。

1.2.4 肝糖原含量的測定

末次灌胃給予受試物30 min后處死動物，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟200 mg，加入4mL三氯乙酸，每管勻漿1 min，將勻漿液倒入離心管，以3 000 r·min-1離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個試管內(nèi)，在沉淀中再加入4mL三氯乙酸勻漿1 min，再次離心15 min，取上清液，并與第一次離心的上清液合并，充分混合，蒽酮法測定肝糖原含量。

1.2.5 遲發(fā)型變態(tài)反應耳腫脹度的測定

每只小鼠腹部去毛，范圍約3 cm ×3 cm，并將含1%DNCB的丙酮麻油溶液 (1：1，V/V)50 μl均勻涂抹致敏，次日強化1次;正常組小鼠去毛后涂抹等量無DNCB的丙酮麻油溶液。致敏7天，將1%DNCB丙酮麻油溶液10 μl均勻涂抹于各組小鼠右耳內(nèi)外兩面進行攻擊，左耳涂抹等量無DNCB的丙酮麻油溶液。攻擊后24 h，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片稱質(zhì)量。左右耳片質(zhì)量之差為腫脹度。

1.2.6 小鼠碳廓清能力的測定

末次給藥30 min后，尾iv印度墨汁 (0.1 ml/10g)。注射前按印度墨汁每1 ml加入生理鹽水4 ml稀釋。墨汁一經(jīng)注入立即計時。分別于注射后2，10 min從動物內(nèi)眥靜脈叢取血20 μl。將取得的血加入2 ml 0.1%碳酸鈉溶液中搖勻。約2 h后用酶標儀在650 nm波長處測定吸光度 (OD)值。按下列公式計算廓清指數(shù) (K)：K=(logOD1-logOD2)/(T10-T2)。式中，OD1為T1(動物注射印度墨汁2 min)時的OD值;OD2為T2(動物注射印度墨汁10 min)時的OD值。吞噬系數(shù)a=K×1/3×體重/(肝重+脾重)［5］。

1.2.7 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠體重的影響

各組小鼠試驗起始和試驗結(jié)束 (30 d)時的體重見表1、表2。經(jīng)單因素方差分析表明，各劑量組與正常對照組間的差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)，未見藥物對試驗動物體重有影響。

2.2 對小鼠負重游泳時間的影響

負重游泳實驗結(jié)果如表3。從表3中可以看出，高劑量組和中劑量組負重游泳時間均高于對照組，統(tǒng)計學分析表明具有顯著性差異 (P＜0.01)。

2.3 對運動后小鼠各項生化指標的影響

各組小鼠運動后生化指標測定結(jié)果見表3。由表3可見給藥組小鼠的血清尿素氮含量低于正常對照組，中、高劑量組與正常對照組差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，說明藥物可降低運動后小鼠的血清尿素含量。小鼠肝糖原含量隨劑量的增加而增加，高劑量組和中劑量組與正常對照組值相比，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，說明藥物具有增加小鼠糖原儲備或減少糖原消耗的作用。中、高劑量組血乳酸濃度和血清尿素氮含量顯著低于對照組 (P＜0.01)，表明該復方能提高血乳酸的清除速度和降低血清尿素氮水平，增加有氧代謝，加快疲勞消除和體力恢復，從而提高對運動負荷的適應性和機體的運動能力。

表1 各試驗組小鼠的初始體重 (n=12，±SD)Tab 1 Mice weight of each experimental group at the beginning of the experiment(n=12，±SD)

表1 各試驗組小鼠的初始體重 (n=12，±SD)Tab 1 Mice weight of each experimental group at the beginning of the experiment(n=12，±SD)

組別 劑量 (g生藥/日·Kg體重)游泳組 (g)血清尿素組氮 (g)肝糖原組 (g)碳廓清組 (g)DTH組 (g).1低劑量組 1.2 19.6 ±2.3 19.7 ±1.6 19.5 ±1.7 19.5 ±1.2 19.8 ±1.2中劑量組 2.5 19.3 ±1.8 19.5 ±1.9 19.6 ±1.4 19.7 ±1.1 19.4 ±1.3高劑量組 7.5 19.4 ±1.4 19.3 ±1.7 19.7 ±2.8 19.4 ±1.3 19.5對照組 - 19.7 ±1.5 19.4 ±1.5 19.8 ±1.4 19.8 ±1.4 19.5 ±1±1.4

表2 各試驗組結(jié)束時小鼠體重 (n=12，±SD)Tab 2 Mice weight of each experimental group at the end of the experiment(n=12，±SD)

表2 各試驗組結(jié)束時小鼠體重 (n=12，±SD)Tab 2 Mice weight of each experimental group at the end of the experiment(n=12，±SD)

組別 劑量 (g生藥/日·Kg體重)游泳組 (g)血清尿素氮組 (g)肝糖原組 (g)碳廓清組 (g)DTH組 (g).5低劑量組 1.2 37.7 ±2.6 38.6 ±2.8 35.1 ±3.4 35.9 ±1.9 35.1 ±3.7中劑量組 2.5 36.5 ±3.7 37.6 ±2.5 36.1 ±2.2 36.7 ±2.7 35.7 ±3.6高劑量組 7.5 35.5 ±3.8 38.2 ±2.6 37.9 ±1.2 36.2 ±2.9 36.5±3.3對照組 - 36.8 ±2.7 36.9 ±2.9 35.6 ±3.3 36.2 ±1.8 36.3 ±2

表3 藥物對運動后小鼠各項生化指標的影響 (n=12，±SD)Tab 3 Effect on some biochemical markers of mice after exercise(n=12，±SD)

表3 藥物對運動后小鼠各項生化指標的影響 (n=12，±SD)Tab 3 Effect on some biochemical markers of mice after exercise(n=12，±SD)

注：與空白對照組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量 (g生藥/日·Kg體重)游泳時間 (min)血清尿素 (mg/dl)肝糖原 (mg/g組織)14.14 ±5.58 10.95 ±0.91 1.91 ±0.12低劑量組 1.2 25.70 ±8.92* 10.21 ±0.87* 2.22 ±0.32*中劑量組 2.5 31.00±9.57＊＊ 9.88±1.14＊＊ 2.45±0.51＊＊高劑量組 7.5 34.14±13.23＊＊ 9.24±1.46＊＊ 2.76±0.32對照組-＊＊

表4 對DTH小鼠耳腫脹度和碳廓清能力a的影響 (n=12，±SD)Tab 4 Effect of on some biochemical markers of mice after exercise(n=12，±SD)

表4 對DTH小鼠耳腫脹度和碳廓清能力a的影響 (n=12，±SD)Tab 4 Effect of on some biochemical markers of mice after exercise(n=12，±SD)

注：與空白對照組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量 (g生藥/日·Kg體重)耳腫脹度 (mg)碳廓清a對照組-＊＊5.03 ±2.34 2.86 ±0.47低劑量組 1.2 7.57 ±2.69* 3.59 ±0.77*中劑量組 2.5 7.77 ±2.13* 3.65 ±0.75*高劑量組 7.5 8.74±3.12＊＊ 4.74±0.81

2.4 對小鼠遲發(fā)型超敏反應 (DTH)耳腫脹度和碳廓清能力a的影響

各組小鼠運動后免疫指標測定結(jié)果見表4。表4結(jié)果提示該復方7.5 g·kg-1組均能夠顯著增加小鼠耳廓腫脹度并且提高小鼠碳廓清能力 (P＜0.01)，具有劑量依賴趨勢。

3 討論

運動性疲勞是指運動時機體生理過程不能持續(xù)，其功能在某一特定水平上和 (或)不能維持預定的運動強度，機體運動能力下降的現(xiàn)象［4］。運動耐力的提高是抗疲勞能力加強最直接的表現(xiàn)，游泳時間的長短可以反應動物運動疲勞的程度。游泳是全身消耗性運動，運動后血清尿素氮明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草復方灌胃30天后，小鼠負重游泳持續(xù)時間均明顯長于對照組，說明該方具有提高小鼠抗運動性疲勞的作用;肝糖原明顯高于對照組，血清尿素氮明顯低于對照組，耳腫脹度和碳廓清能力a明顯高于對照組，表明其能提高小鼠免疫力，增加有氧代謝，加快疲勞消除和體力恢復，從而提高對運動負荷的適應性和機體的運動能力。

文獻報道，蛹蟲草含有復雜的化學成分，已經(jīng)分離的有蛹蟲草多糖、蟲草素、甲基腺昔、蟲草環(huán)膚A、麥角幽醇等。研究發(fā)現(xiàn)黃芪提取物可增強人體免疫細胞抵抗艾滋病病毒，并對人體一些器官起到延緩衰老的作用。而紅參具有大補元氣，固脫生津，安神等作用，能調(diào)節(jié)神經(jīng)、心血管及內(nèi)分泌系統(tǒng)，促進機體物質(zhì)代謝及蛋白質(zhì)和RNA，DNA的合成等作用。飼喂首烏乙醇浸膏能明顯提高老年大鼠外周淋巴細胞DNA的損傷修復能力，使脾巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)明顯提高。綜上所述，復方蛹蟲草制劑從整體上調(diào)整和改善機體運動狀態(tài)下的內(nèi)環(huán)境平衡，加快疲勞消除和體力恢復。實驗結(jié)果提示其有一定的抗運動性疲勞和增強免疫力的作用。

［1］ Won S Y，Park E H.Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris［J］.J Ethnopharmacol，2005，96(3)：555-561.

［2］周枝鳳，梁逸曾，李博巖.人工蠶蛹蟲草和冬蟲夏草水溶性成分的相對歸屬分析［J］.分析化學，2004，32(5)561-564.

［3］陳順志.冬蟲夏草和北蟲草研究進展［J］.中國生化藥物 (Chin JBiochem Pharm)，1995，16(5)：242-245.

［4］李建武，蕭能庚，余瑞元，等.生物化學實驗原理和方法［M］.北京：北京大學出版社，1997：22-27.

［5］徐叔云主編.藥理實驗方法學［M］.第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：754，810.