譚文波 王振富
湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北 恩施 445000
馬鞭草 (Verbena officinalis L.)為馬鞭草科馬鞭草屬植物馬鞭草的全草,具有清熱解毒、通經(jīng)散瘀、利尿消腫、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)神經(jīng)生長因子介導(dǎo)的軸突生長等功效[1]。常用于治療咽喉腫痛,跌打損傷等癥”。湖北恩施馬鞭草資源極為豐富,在民間已有廣泛的應(yīng)用,有很好的藥用開發(fā)應(yīng)用價(jià)值[2]。馬鞭草苷具有多種藥理活性,尤其是在神經(jīng)保護(hù)方面,其作用機(jī)制更是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑,因此對老年癡呆、帕金森氏病等神經(jīng)退行性病變的防治具有很好的作用[3]。目前有關(guān)馬鞭草防治老年癡呆作用的研究尚無完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。為此,我們觀察本地區(qū)馬鞭草水煎液對AD模型小鼠的保護(hù)作用,旨在為進(jìn)一步研制開發(fā)該藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
1.1 動(dòng)物 2月齡KM種小鼠40只,體重20.0±2.1g,雌雄各半,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供。
1.2 藥物與試劑 馬鞭草水煎液:取購于恩施藥材公司的馬鞭草,用水煎煮3次,過濾后,濃縮成lg/ml的溶液,即得 (水煎液由本院自制)。維生素E(盛澤化工),D-半乳糖 (上海恒信化學(xué)試劑有限公司),小鼠總β淀粉樣蛋白 (Aβ)Elisa試劑盒 (上海博耀生物科技有限公司)。
1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及器械 GL-20GII型高速低溫離心機(jī),避暗實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng),Multikan MK3酶標(biāo)儀,電子分析天平,內(nèi)切式組織勻漿機(jī),低溫冰箱。
2.1 分組及給藥 40只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、馬鞭草組和陽性組,每組10只,雌雄各半。除對照組外,其他各組均每天頸背部皮下注射5%D-半乳糖生理鹽水溶液0.025ml/g,對照組每天頸背部皮下注射等量的生理鹽水,連續(xù)注射42d。造模同時(shí)開始灌胃給藥,馬鞭草組按20g/kg體重給藥,陽性組給予維生素E 50mg/kg灌胃,對照組與模型組每天灌服等量生理鹽水,連續(xù)用藥42d。
2.2 避暗實(shí)驗(yàn) 于43d將小鼠背著洞口放人明室,記錄首次放入5min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室被電擊次數(shù) (錯(cuò)誤次數(shù)),作為學(xué)習(xí)獲得成績;24h后再次測驗(yàn),記錄潛伏期 (即將小鼠放人明室開始計(jì)時(shí),到鼠體1/3進(jìn)入暗室觸電的時(shí)間)和5min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室被電擊次數(shù) (錯(cuò)誤次數(shù)),作為記憶保持成績。
2.3 Aβ含量測定 行為學(xué)測試后,摘取小鼠眼球取血約1ml,血液離心取血清置于4℃冰箱儲存待測。取血后,迅速斷頭取腦,放入冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱重,放入玻璃勻漿器中,加入冷的生理鹽 (生理鹽水的體積總量是腦組織重量的9倍),用內(nèi)切式組織勻漿器進(jìn)行勻漿 (勻漿時(shí)間10秒/次,間隙30秒,連續(xù)5~6次,在冰水中進(jìn)行)。將制備好的10%勻漿用低溫離心機(jī)3000r/min左右離心10~15分鐘,取適量離心好的勻漿上清液備用。Aβ含量測定按試劑盒說明進(jìn)行。
2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。
3.1 馬鞭草水煎液對AD模型小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響見表1。從表1可見,與對照組小鼠比,AD模型組小鼠的首次避暗錯(cuò)誤次數(shù)和24h后避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多,24h避暗潛伏期明顯縮短 (P<0.01),表明AD模型組小鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶障礙;與模型組小鼠比,馬鞭草組及陽性組小鼠,首次避暗錯(cuò)誤次數(shù)和24h后避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少,24h避暗潛伏期明顯延長 (P<0.01),說明馬鞭草改善其學(xué)習(xí)及記憶能力,具有明顯促智作用。
表1 避暗實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果
3.2 馬鞭草水煎液對AD模型小鼠Aβ含量的影響見表2。
表2 Aβ含量測定結(jié)果
從表2可見,與對照組比較,AD模型組小鼠的總β淀粉樣蛋白在血清和腦組織的含量都顯著增加 (P<0.01),表明D-半乳糖可增加小鼠β淀粉樣蛋白的表達(dá);與模型組小鼠比較,馬鞭草組及陽性組小鼠血清和腦組織內(nèi)β淀粉樣蛋白的含量顯著降低 (P0.01),表明馬鞭草抑制了AD模型小鼠β淀粉樣蛋白的表達(dá)。
老年癡呆癥又稱阿爾茨海默病,是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病。臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化。其特征性病理變化為大腦皮層萎縮,并伴有β淀粉樣蛋白沉積,神經(jīng)原纖維纏結(jié),大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少,以及老年斑的形成。
本實(shí)驗(yàn)以5%D-半乳糖生理鹽水溶液按0.025ml/g頸背部皮下注來制備AD小鼠模型。通過避暗行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與對照組小鼠比較,較AD模型組小鼠首次避暗錯(cuò)誤次數(shù)和24h后避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多,避暗潛伏期明顯縮短 (P<0.01),表明AD模型小鼠出現(xiàn)了明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙,說明老年癡呆小鼠模型的制備是成功的。但與模型組小鼠比較,馬鞭草水煎液治療組及維生素E治療組小鼠,首次避暗錯(cuò)誤次數(shù)和24h后避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少,避暗潛伏期明顯延長 (P<0.01),說明馬鞭草水煎液改善了其定向?qū)W習(xí)及記憶能力,對老年癡呆小鼠具有明顯的治療作用。
Aβ的神經(jīng)毒性學(xué)說是目前公認(rèn)的老年癡呆癥發(fā)生的最主要原因。該學(xué)說認(rèn)為,沉積在神經(jīng)元周圍的Aβ通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡造成AD神經(jīng)元丟失;Aβ分子的β片層結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)Aβ聚集成不溶性纖維,不易被蛋白酶降解,進(jìn)一步形成極難溶的沉淀,由此生成老年斑;淀粉樣斑塊部位氧化應(yīng)激升高而造成老化損傷[4,5]。這種經(jīng)毒性損傷會促使老年癡呆癥出現(xiàn)特征性病理變化。形成這種變化的直接原因是β淀粉樣蛋白的過度表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組小鼠的β淀粉樣蛋白在血清和腦組織的含量都顯著增加(P<0.01),與模型組小鼠比較,馬鞭草組及陽性組小鼠血清和腦組織內(nèi)β淀粉樣蛋白的含量顯著降低 (P<0.01),說明D-半乳糖通過增加小鼠β淀粉樣蛋白的表達(dá),造成神經(jīng)毒性損傷,使其衰老癡呆;而馬鞭草水煎液可抑制AD模型小鼠β淀粉樣蛋白的表達(dá),從而有效地避免了神經(jīng)毒性損傷,使AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯的改善。證明馬鞭草水煎液能提高AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,β淀粉樣蛋白表達(dá)水平降低可能是其作用機(jī)制之一。
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