尹文東,于 庭,梁 艷,陽(yáng)幼榮,肖 漓,王 蘭,王 瑩,史迎昌,張俊仙,吳雪瓊*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春 130041;2.中國(guó)人民解放軍309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所北京 100091）

結(jié)核病是一種非常古老且迄今為止仍然嚴(yán)重影響人類健康的呼吸道傳染病。具有近百年歷史的卡介苗,由于其亞系的變異性和有限的保護(hù)作用,在應(yīng)用中備受爭(zhēng)議[1]。母牛分枝桿菌菌苗(Mycobacterium Vaccae,MV）具有與結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB）相似的抗原[2],富含介導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原,缺少介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的抗原,是一種良好的雙向免疫治療制劑[3]。Ag85復(fù)合物(主要由Ag85A、Ag85B和Ag85C組成）是MTB分泌的重要蛋白,具有分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶(Mycolyl-transferase）活性,在細(xì)胞壁的合成階段發(fā)揮重要作用[4]。該復(fù)合物可以激發(fā)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫,這對(duì)于以細(xì)胞免疫為主的機(jī)體抗結(jié)核反應(yīng)具有重要意義。本研究將結(jié)核分枝桿菌rAg85A和/或rAg85B蛋白與MV聯(lián)合免疫小鼠,通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察兩種蛋白的免疫效果,以期研發(fā)現(xiàn)有結(jié)核病治療性疫苗的增強(qiáng)劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17-20 g、SPF級(jí)6-8周齡雌性BALB/c小鼠60只,購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑及其來源rAg85A、rAg85B蛋白由解放軍309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所克隆、表達(dá)、純化;凍干皮內(nèi)注射用卡介苗購(gòu)自成都生物制品研究所;凍干注射用母牛分枝桿菌菌苗(22.5 μ g/支）購(gòu)自安徽龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司;辣根過氧化物酶(HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG、IgG1和 IgG2a購(gòu)自Southern Biotech;小鼠 ELISPOT試劑盒、Fluorescein Isothiocyanate(FITC）標(biāo)記的抗鼠 IFN-γ、Phycoerythrin(PE）標(biāo)記的抗鼠白介素-4(IL-4）、CD3-Percp、CD8-APC、溶血?jiǎng)?、破膜劑和?2a/γ同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 動(dòng)物分組與處理60只小鼠隨機(jī)分為下列6組:(1）PBS組:每只小鼠肌肉注射 100 μ l PBS(pH7.4）;(2）BCG組:每只小鼠皮內(nèi)注射 100 μ l BCG;(3）MV 組:每只小鼠肌肉注射100 μ l MV(22.50 μ g）;(4）rAg85A-MV 組:每只小鼠肌肉注射100 μ l的rAg85A 蛋白(100 μ g）和 MV(22.50 μ g）;(5）rAg85BMV組:每只小鼠肌肉注射 100 μ l的rAg85B蛋白(100 μ g）和 MV(22.50 μ g）;(6）rAg85A-rAg85B-MV組:每只小 鼠肌肉注射 100 μ l的 rAg85A(100 μ g）、rAg85B 蛋白(100 μ g）和 MV(22.50 μ g）;每2 周免疫1次,共免疫3次。末次免疫結(jié)束后第14天,摘眼球采血,分離血清用于抗體檢測(cè),抗凝血用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè);解剖小鼠取脾臟,分離T淋巴細(xì)胞,檢測(cè)脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)。

1.4 ELISA測(cè)定血清抗體以100 μ l rAg85A/rAg85B蛋白(終濃度分別為5 μ g/ml）包被于酶標(biāo)板中,4℃過夜;用PBST(含0.05%吐溫20的PBS）洗板3次 ;每孔加入 200 μ l含 10%胎牛血清(FBS）的PBS,37℃封閉1小時(shí),PBST洗板3次;加入1∶100倍稀釋的待測(cè)血清,37℃溫育2小時(shí),PBST洗板5次;加入1:6000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a抗體,37℃溫育1小時(shí),PBST洗板7次;加入TMB底物顯色15分鐘,2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。以空白對(duì)照調(diào)校零點(diǎn),酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm的OD值,以兩孔平均值作為終結(jié)果。

1.5 ELISPOT檢測(cè)脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)小鼠脾臟在200目細(xì)胞篩上研磨,將懸液離心,用淋巴細(xì)胞分離液和細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640離心、洗滌、制備淋巴細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)脾淋巴細(xì)胞濃度為4×106/ml。每份標(biāo)本需微孔板3孔,先向每孔加入100 μ l淋巴細(xì)胞懸液,再向陰性孔、陽(yáng)性孔和檢測(cè)孔中分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液、植物血凝素(終濃度為20 μ g/ml）、rAg85A/rAg85B 蛋白(終濃度分別為 20 μ g/ml）,置 37℃CO2溫箱中溫育 48小時(shí),按照ELISPOT試劑盒說明操作。以各組小鼠空白對(duì)照孔為對(duì)照,計(jì)算各組小鼠檢測(cè)孔的細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)全血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)Th1、Th2百分比每個(gè)標(biāo)本取一支有蓋的Faclon管,各加入500 μ l抗凝血 、500 μ l細(xì)胞培養(yǎng)液 RPMI-1640 和22 μ l rAg85A/rAg85B蛋白(終濃度分別為20 μ g/ml）,混勻后置于37℃避光孵育4-6小時(shí);每份標(biāo)本取兩支試管 ,標(biāo)記1-對(duì)照 ,2-樣本,每管各加入 200 μ l刺激好的血,再分別加入CD3-Percp和CD8-APC,混勻后置室溫避光孵育10分鐘;加入破膜的A液,混勻后避光孵育5分鐘;用蒸餾水按1∶10稀釋溶血素,每管各加入2 ml,混勻后避光孵育10分鐘;取出后1 200 rpm離心5分鐘,棄去上清,加入破膜的B液,同時(shí)加入胞內(nèi)熒光抗體,1管加入同型對(duì)照γ 2a/γ,2管加入IFN-γ-FITC/IL-4-PE,振蕩混勻,室溫避光孵育15分鐘;每管各加入含2%FBS的PBS,1 200 rpm離心5分鐘,棄上清;各加入500 μ l PBS,應(yīng)用BD 公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有計(jì)量數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示。使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。假設(shè)檢驗(yàn)的顯著性水準(zhǔn)取 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清抗體水平通過ELISA方法檢測(cè)各組小鼠血清中抗rAg85A/rAg85B蛋白抗體IgG、IgG1和IgG2a的結(jié)果見表1。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠血清抗體水平均顯著高于三個(gè)對(duì)照組(P＜0.001）,三個(gè)實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異(P＞0.05）;BCG組和MV組小鼠抗體水平也顯著高于PBS組(P＜0.05）;各組小鼠IgG2a水平均略高于IgG1。

2.2 小鼠脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)用ELISPOT方法檢測(cè)各組小鼠脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)的結(jié)果見表2。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)均顯著高于PBS組(P＜0.05）,升高最多的是BCG組,其次是rAg85A-rAg85B-MV組和MV組,這三組間無顯著差別(P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清中抗rAg85A/rAg85B蛋白抗體水平

表2 小鼠脾臟分泌IFN-γ的 T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)

2.3 全血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)Th1、Th2百分比及 Th1/Th2比值流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠全血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)Th1、Th2百分比及Th1/Th2比值的結(jié)果見表3。Th1百分比結(jié)果顯示:rAg85A-rAg85B-MV組小鼠較其它5組升高最顯著(P＜0.001）;MV組較陰性對(duì)照組升高較多(P＜0.05）,低于三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分泌水平(P＜0.05）,與BCG組無顯著性差異(P＞0.05）;rAg85AMV組與rAg85B-MV組無顯著差別(P＞0.05）。Th2百分比結(jié)果顯示:MV組較陰性對(duì)照組和三個(gè)實(shí)驗(yàn)組升高顯著(P＜0.05）,與 BCG組差別不大(P＞0.05）;三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與PBS組間也無顯著差別(P＞0.05）。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組Th1/Th2比值均明顯高于三個(gè)對(duì)照組(P＜0.05）,rAg85A-rAg85B-MV組較其它5組升高最顯著(P＜0.001）。

表3 全血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi) Th1、Th2的百分比及Th1/Th2 比值 (±s）

表3 全血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi) Th1、Th2的百分比及Th1/Th2 比值 (±s）

組別 小鼠數(shù)量(只）Th1(%） Th2(%） Th1/Th2 PBS 10 0.89±0.48 4.23±2.36 0.21±0.01 BCG 10 1.58±0.34 5.96±0.38 0.26±0.04 MV 10 2.29±0.61 8.10±1.37 0.28±0.05 rAg85A-MV 10 2.84±0.28 5.03±1.52 0.59±0.14 rAg85B-MV 10 3.70±0.25 4.61±0.53 0.81±0.13 rAg85A-rAg85B-MV 10 6.17±1.21 4.23±1.5 71.56±0.40

3 討論

世界衛(wèi)生組織20世紀(jì)90年代關(guān)于結(jié)核病研究與發(fā)展規(guī)劃中指出:MV是唯一被推薦的免疫治療制劑。其藥效學(xué)和免疫學(xué)研究顯示:MV能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng);啟動(dòng)Th1型細(xì)胞免疫,刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ和IL-2。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明:用MV免疫小鼠,再感染MTB后,小鼠脾臟分泌多量IFN-γ和IL-2[5],可有效的抵御MTB的感染。MV用于人類結(jié)核病治療具有一定的促進(jìn)菌陽(yáng)肺結(jié)核陰轉(zhuǎn)、空洞閉合、縮短療程的作用。Johnson[6]等報(bào)道:選擇新近診斷的肺結(jié)核病人,化療7天后,實(shí)驗(yàn)組加用MV,對(duì)照組加用安慰藥,實(shí)驗(yàn)組1個(gè)月后痰菌陰轉(zhuǎn)率及6個(gè)月后胸片改善情況均好于對(duì)照組(P＜0.05）。曹賦[7]等收治了328例復(fù)治肺結(jié)核患者,隨機(jī)分為MV+化療組和單純化療組,經(jīng)過半年治療后,發(fā)現(xiàn)MV聯(lián)合化療組的空洞閉合率較單純化療組明顯升高(P＜0.001）。因MV應(yīng)用方法簡(jiǎn)便,無毒性反應(yīng),不良反應(yīng)輕微,目前在臨床上已廣泛用于結(jié)核病的輔助治療。

Ag85復(fù)合物是目前在結(jié)核病疫苗研制方面最受關(guān)注的抗原。周曄[8]通過實(shí)驗(yàn)證明:重組Ag85A蛋白具有較好的免疫原性,能有效刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞毒活性。Giri[9]應(yīng)用Ag85AB融合蛋白疫苗治療小鼠結(jié)核病模型,實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟和肺臟細(xì)菌數(shù)較對(duì)照組顯著減少(P＜0.05）,治療后的小鼠不但增強(qiáng)了Th1型免疫反應(yīng),而且抑制了IL-4的分泌。綜合以上研究報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)將rAg85A、rAg85B蛋白與MV聯(lián)合應(yīng)用,研究其免疫效果,以尋求提高M(jìn)V治療效果的增強(qiáng)劑。目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

本文研究結(jié)果顯示,rAg85A和/或 rAg85B蛋白與MV聯(lián)合免疫后,小鼠血清中抗 rAg85A和/或rAg85B蛋白抗體水平均顯著高于三個(gè)對(duì)照組,說明rAg85A和rAg85B蛋白具有較好的免疫原性,與MV聯(lián)合免疫成功。姜德華[10]等用Ag85B/ESAT6融合蛋白,聯(lián)合DDA/MPL為佐劑免疫BALB/c小鼠,其產(chǎn)生的特異性IgG抗體效價(jià)較對(duì)照組明顯升高,本實(shí)驗(yàn)中MV本身具有免疫佐劑作用,與Ag85聯(lián)合應(yīng)用,無需另外加佐劑便可獲得較好的免疫效果。目前研究表明BALB/c小鼠IgG2a升高代表機(jī)體主要是以Th1型反應(yīng)為主,IgG1升高代表機(jī)體主要是以Th2型反應(yīng)為主。本研究各組小鼠血清IgG2a水平均略高于IgG1,說明各組小鼠的免疫狀況以Th1型反應(yīng)為主。Giri[11]等用Ag85AB復(fù)合蛋白免疫小鼠后,產(chǎn)生了抗Ag85AB蛋白的特異性IgG抗體,且IgG2a水平較高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道符合。

IFN-γ是Th1類細(xì)胞分泌的最重要的免疫分子,貫穿于抗結(jié)核的整個(gè)過程,它不僅可以激活巨噬細(xì)胞,酸化吞噬體,還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的能力,刺激細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的增殖分化。Young[12]以一種高度減毒的牛痘病毒(modified vaccinia ankara virus,MVA）為載體,將編碼Ag85A的基因?qū)肫渲?組成重組疫苗免疫小鼠,激發(fā)了強(qiáng)烈的Th1型反應(yīng)。本文通過ELISPOT方法檢測(cè)各組小鼠脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù),結(jié)果顯示三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)均高于陰性對(duì)照組,證明 BCG、MV、rAg85A 和/或 rAg85B蛋白與MV聯(lián)合免疫均具有較強(qiáng)的刺激T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。

全血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)Th1、Th2百分比及Th1/Th2比值可以反應(yīng)機(jī)體的免疫應(yīng)答類型,Th1百分比升高代表機(jī)體以細(xì)胞免疫為主,Th2百分比升高代表機(jī)體以體液免疫為主。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),三個(gè)實(shí)驗(yàn)組Th1型細(xì)胞百分比及Th1/Th2比值較三個(gè)對(duì)照組均有升高,進(jìn)一步證明rAg85A和rAg85B蛋白聯(lián)合MV可以明顯增強(qiáng)小鼠的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng);BCG組和MV組小鼠Th2百分比升高較高,說明二者不僅可以產(chǎn)生細(xì)胞免疫,也可刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫。Malowany[13]等也獲得類似的結(jié)果,他們將表達(dá)Ag85A的樹突狀細(xì)胞制成疫苗,發(fā)現(xiàn)其在提高CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值方面均較單獨(dú)Ag85A蛋白疫苗升高顯著。Lozes[14]等用Ag85A、Ag85B和Ag85C疫苗免疫小鼠,結(jié)果顯示:前兩種DNA疫苗的免疫效果較好,可刺激小鼠產(chǎn)生較高的IFN-γ,IL-12和腫瘤壞死因子,而IL-4、IL-6和IL-10水平較低或檢測(cè)不出,間接反映出Ag85A和Ag85B能夠升高Th1型細(xì)胞比例,抑制Th2型細(xì)胞分泌。

總之,結(jié)核分枝桿菌rAg85A和rAg85B蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性,與MV聯(lián)合免疫可增強(qiáng)其Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。我們將在結(jié)核病動(dòng)物模型上進(jìn)一步研究它們聯(lián)合免疫的治療效果。

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