陳麗麗,黃靚妹,詹紅艷,曹亦賓,史 楠,黎 潔,王丹丹

(唐山工人醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科;2.急診內(nèi)科,河北 唐山 063000）

腦源性生長(zhǎng)因子(BDNF）是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族的一員,研究發(fā)現(xiàn)BDNF與癲癇密切相關(guān),組織缺血缺氧后腦內(nèi)BDNF釋放量明顯增多,且對(duì)癲癇有保護(hù)作用。丹參多酚酸鹽注射液是國(guó)家二類中藥新藥。自2005年5月獲批應(yīng)用以來,證實(shí)它具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改善微循環(huán)、抗氧化損傷的作用。本課題擬采用免疫組織化學(xué)方法觀察匹魯卡品(PILO）所致大鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá),探討丹參多酚酸鹽干預(yù)注射后對(duì)大鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性成年Wistra大鼠15只,體重200-250 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。將動(dòng)物置于20℃、安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)。匹魯卡品(PILO）,美國(guó)SIGMA公司;,兔抗大鼠BDNF多克隆抗體與SABC免疫組化試劑盒,均由武漢博士德公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將大鼠隨機(jī)分為(1）丹參多酚酸鹽干預(yù)組5只,用2%戊巴比妥鈉0.1 ml/50 g將大鼠麻醉,固定于立體定位儀上,按大鼠解剖圖譜取前囟后2.0 mm、左旁開1.0mm,鉆開顱骨,校準(zhǔn)微量進(jìn)樣器,抽取10 mg/kg,垂直進(jìn)針至硬腦膜下3.5 mm(左側(cè)腦室）,注射完畢后拔出進(jìn)樣器,撒上青霉素粉預(yù)防感染,縫合皮膚后放回飼養(yǎng)籠內(nèi);第二天先腹腔注入東莨宕堿1 mg/kg,以拮抗其外周膽堿能反應(yīng),半小時(shí)后腹腔注射匹魯卡品(PILO）350 mg/kg。(2）生理鹽水干預(yù)組5只,用相同的方法側(cè)腦室注入等量生理鹽水,第二天腹腔注射PILO350 mg/kg。(3）對(duì)照組5只,給大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。觀察上述各組大鼠有無癲癇發(fā)作。

1.2.2 標(biāo)本處理 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在腹腔給藥后12小時(shí)麻醉,固定在立體定位儀上,剪開胸腹腔,暴露心臟、肝臟,自心尖向右上45°進(jìn)針至主動(dòng)脈起始端?？焖俟嘧⑸睇}水100 ml后接4%多聚甲醛(PF）200ml灌注。若大鼠出現(xiàn)四肢僵直、肝臟變白立即停止灌注。剪開顱骨,取中腦至小腦之間的腦組織,放入4%PF后固定2小時(shí),最后移入30%蔗糖溶液4℃過夜。

1.2.3 冰凍切片 將腦組織修材并固定于基座上,自中腦向后行20 μ m冠狀連續(xù)切片,并放入磷酸鹽緩沖液中用于BDNF免疫組化。

1.2.4 BDNF的SABC免疫組織化學(xué)染色 組織片飄浮于PBS配制的1%H2O2中,室溫下10 min消化內(nèi)生過氧化物酶,PBS 5 min/次洗 2次;然后按SABC免疫組織試劑盒說明進(jìn)行染色。用PBS取代一抗作陰性對(duì)照。置換試驗(yàn)用正常兔血清代替兔抗大鼠BDNF多克隆抗體。BDNF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù):在光學(xué)顯微鏡下,每組隨機(jī)抽取5張切片6個(gè)高倍視野。計(jì)算海馬CA1區(qū)高倍視野下的BDNF陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示為ˉx±s。BDNF陽性細(xì)胞均數(shù)各組間比較行t檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)顯著性為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

根據(jù)Racine[1]制定的標(biāo)準(zhǔn)判定癲癇發(fā)作:Ⅰ級(jí):面部陣攣;Ⅱ級(jí):面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí):面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭+前肢陣攣;Ⅳ級(jí):面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭+前肢陣攣+后肢站立;Ⅴ級(jí):面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒。5只鹽水干預(yù)組大鼠在注射PILO后10-20分鐘均可見癲癇發(fā)作。但丹參多酚酸鹽組有4只大鼠在注射PILO后30-40分鐘見癲癇發(fā)作,但程度較弱。對(duì)照組無癲癇發(fā)作。

2.2 BDNF免疫組化結(jié)果

各組海馬CA1區(qū)BDNF陽性細(xì)胞數(shù)(見表1）,生理鹽水及丹參多酚酸鹽干預(yù)組均可見到顆粒細(xì)胞及椎體細(xì)胞中的BDNF的表達(dá)。NS、丹參多酚酸鹽干預(yù)組BDNF陽性細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;而且丹參多酚酸鹽組高于生理鹽水組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。BDNF陽性細(xì)胞數(shù)形態(tài)見圖1。

表1 各組海馬 CA1區(qū)BDNF陽性細(xì)胞數(shù)(±s）

表1 各組海馬 CA1區(qū)BDNF陽性細(xì)胞數(shù)(±s）

注:*與對(duì)照組比較(P＜0.05）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;#與NS組比較(P＜0.05）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別 n BDNF陽性細(xì)胞數(shù)NS干預(yù)組 5 14.520±2.836*丹參多酚酸鹽干預(yù)組 5 25.631±3.154*#對(duì)照組 5 8.625±1.175

圖1 BDNF陽性細(xì)胞數(shù)形態(tài)(BDNF免疫組化染色,×400）

3 討論

腦源性生長(zhǎng)因子是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族中的一員,它是1982年從豬腦中分離到的,由120各氨基酸殘基組成的細(xì)胞外因子。BDNF除了對(duì)特異性神經(jīng)元的存活、鑒別和維持其功能方面起作用外,也對(duì)突觸遞質(zhì)有急性的敏銳的興奮作用,能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、誘發(fā)谷氨酸受體翻譯后調(diào)節(jié)。神經(jīng)元內(nèi)BDNF主要定位于細(xì)胞體和軸突,海馬顆粒細(xì)胞軸突苔狀纖維有明顯的BDNF免疫活性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,軸突是 BDNF發(fā)揮作用的主要部位。Tsankora[2]等研究發(fā)現(xiàn),癲癇持續(xù)發(fā)作后海馬、內(nèi)嗅皮層、杏仁核、外周皮層中BDNF的表達(dá)明顯增高。本研究中,生理鹽水及丹參多酚酸鹽干預(yù)組均可見到顆粒細(xì)胞及椎體細(xì)胞中的BDNF的高表達(dá),這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Vezzami[3]等研究發(fā)現(xiàn):在癲癇發(fā)作后100分鐘時(shí),BDNF的免疫反應(yīng)性在海馬CA1區(qū)、齒狀回和內(nèi)嗅皮層內(nèi)顯著升高。林衛(wèi)紅[4]等在大鼠杏仁核點(diǎn)燃癲癇模型中,發(fā)現(xiàn)大鼠顳葉和海馬BDNF的表達(dá)隨著癲癇發(fā)作次數(shù)的增加而增高。有人對(duì)癲癇發(fā)生過程中BDNF增高的機(jī)制進(jìn)行了研究,在海人藻酸(Kainic acid KA）誘導(dǎo)的癲癇模型中發(fā)現(xiàn)依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶Ⅱ、Ⅳ的抑制劑KN-62能阻斷癇后BDNF mRNA水平的升高,這說明依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶Ⅱ、Ⅳ是引起癲癇發(fā)作后BDNF mRNA水平升高的一個(gè)必要環(huán)節(jié)。Hagihara等[5]研究發(fā)現(xiàn)匹魯卡品誘發(fā)的癲癇模型中BDNF的高表達(dá)具有促進(jìn)新生神經(jīng)細(xì)胞增殖的作用。

丹參能緩解缺血腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的紊亂,減少癇樣放電,抑制腦缺血所致的β-腦啡肽異常升高,減輕腦損傷和腦水腫[6]。丹參多酚酸鹽注射液主要是丹參的水溶性活性成分,具有改善微循環(huán)、抗氧化損傷、提高驚厥閾的作用,可通過多途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移,促進(jìn)血管生成[7]。癲癇發(fā)作引起內(nèi)源性BDNF蛋白的表達(dá)增強(qiáng),與興奮-抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA-Glu平衡失調(diào)而致的興奮性增高密切相關(guān),這些變化可能是導(dǎo)致神經(jīng)損傷的重要因素。本研究中,側(cè)腦室注入丹參多酚酸鹽后腹腔注射PILO,丹參多酚酸鹽干預(yù)組BDNF的表達(dá)更多,細(xì)胞著色更深。丹參多酚酸鹽能明顯降低急性癲癇痙攣性大鼠的發(fā)作等級(jí)和發(fā)作時(shí)間,可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)GABA-Glu的失衡,促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)有關(guān),使癲癇發(fā)作后海馬區(qū)BDNF的表達(dá)增高,產(chǎn)生特異性抑制神經(jīng)元損傷的作用。其具體作用機(jī)制和作用途徑有待進(jìn)一步研究。

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