曾昭偉,王學(xué)謙

(1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院,天津 300070;2.天津市天津醫(yī)院 檢驗(yàn)科,天津 300211）

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO）是一種促進(jìn)紅系造血前體細(xì)胞分化、繁殖的細(xì)胞因子,相對(duì)分子量為32-39KD,在調(diào)節(jié)人體循環(huán)紅細(xì)胞,維持一定濃度中有重要作用。EPO釋放增加導(dǎo)致紅細(xì)胞增多,釋放減少則導(dǎo)致紅細(xì)胞減少,它和多種疾病相關(guān)[1,2]。EPO缺乏最常見(jiàn)的原因是慢性腎衰。而生成過(guò)度常見(jiàn)于組織缺氧、血紅蛋白血癥。

EPO含量的高低在某些疾病的診斷中,是重要的檢測(cè)項(xiàng)目。現(xiàn)在,ELISA方法由于簡(jiǎn)便快捷、成本低,靈敏度、特異度均較高等優(yōu)點(diǎn),成為研究的重要方向。

由于抗EPO抗體可測(cè)定有免疫活性的EPO,制備抗體及酶標(biāo)抗體在ELISA檢測(cè)體系中具有重要應(yīng)用價(jià)值。本研究從來(lái)源充足、純度較高的rhEPO入手,免疫動(dòng)物制備多克隆抗體,并標(biāo)記酶標(biāo)抗體,為進(jìn)一步建立EPO相關(guān)試劑盒做好準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料(1）主要試劑:rhEPO購(gòu)自華北金坦生物技術(shù)股份有限公司;pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS）;胎牛血清來(lái)自天津沃克生物科技公司;BSA購(gòu)自天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;醋酸鈉、高碘酸鈉、硼氫化鈉均購(gòu)自天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;弗氏佐劑購(gòu)自sigma公司。(2）主要儀器:電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠;PH計(jì)、AL104電子天平均購(gòu)自天津市天馬儀器廠;磁力攪拌器購(gòu)自天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HD-A電腦采集器及HD-3紫外檢測(cè)儀均購(gòu)自上海滬西分析儀器有限公司;微孔濾膜購(gòu)自Whatman;透析袋購(gòu)自 specteum;辣根過(guò)氧化物酶(HRP）購(gòu)自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的純化 純化rhEPO,凝膠在平衡液中充分溶脹處理。把處理好的凝膠預(yù)先裝柱,裝好凝膠柱后,用平衡液過(guò)洗柱子后上樣,樣品與柱床體積比例為5%,按照體積比是凝膠的5倍,用平衡液0.1M的PBS充分洗滌凝膠,連接收集器和分光光度計(jì),波形會(huì)在電腦上反映出來(lái),直到將波形沖至基線,并維持一段時(shí)間。換高濃度磷酸鹽充分沖洗直至新的平衡。洗脫液沖洗時(shí)體積約為凝膠柱體積的5倍。收集洗脫液洗下的峰,各部分組分應(yīng)該加入中和液。

1.2.2 兔抗人EPO多克隆抗體的制備及鑒定 用純化的rhEPO抗原純品免疫新西蘭家兔2只,6-8周齡,雄性。(1）每只兔后足腳墊各注射或完全福氏佐劑0.2 ml(相當(dāng)于卡介苗每兔5 mg）;10-14天后兩側(cè)窩淋巴結(jié)可腫大,如蠶豆大小,即可作淋巴結(jié)注射。(2）第一針于兩側(cè)窩淋巴結(jié)內(nèi)注射佐劑抗原乳劑0.5 ml(1 mg/ml）,一側(cè)一個(gè)淋巴結(jié)。每個(gè)淋巴結(jié)內(nèi)注射0.25 ml。(3）注射加強(qiáng)針,途徑、劑量同第一針,間隔約2周。(4）試血測(cè)效價(jià),合格則放血。從家兔頸動(dòng)脈處放血,分離血清后,-20℃保存。(5）鑒定:制備瓊脂板,抗原在板的中央,將多克隆抗體倍比稀釋劑3個(gè)濃度環(huán)形等距分列于外周,37℃保溫24 h。將制備的多克隆抗體,與CEA、PSA抗原采用間接ELISA法進(jìn)行反應(yīng),鑒定特異性。

1.2.3 抗體的親和層析純化 (1）鹽析法粗提純:取2 ml抗體加2 ml生理鹽水,于攪拌下逐滴加入4 ml飽和硫酸銨,硫酸銨的終飽和度為50%,4℃,3 h以上,充分沉淀。離心3 000 rpm,30 min,棄上清,生理鹽水溶解沉淀,逐滴加飽和硫酸銨1 ml,置4℃3 h以上,(NH4）2SO4的飽和度為40%,以0.02M pH 7.4PB溶解至2 ml裝入透析袋。(2）親和層析:用平衡液浸泡SPA-Sepharose 4B凝膠15-30 min,用平衡液充分洗滌直至波形到基線。鹽析過(guò)的抗體純化產(chǎn)物加樣,室溫吸附30 min。再用平衡液沖洗至基線,以洗脫雜蛋白。用pH6的洗脫液洗脫,收集峰值出的洗出液。重新洗至平衡后,用pH3的洗脫液洗脫,收集峰值出的洗出液。洗出液各個(gè)組分均加入中和液,將含蛋白的洗脫液裝入透析袋,對(duì)pH7.4PB(含0.02%疊氮鈉）4℃透析過(guò)夜?jié)饪s。洗脫得到的抗體過(guò)0.45 μ m 濾膜 。

1.2.4 酶標(biāo)記EPO抗體 (1）取HRP10 mg,溶入10 mM乙酸鈉溶液中電磁攪拌,直至溶解。加入0.2M的高碘酸鈉,室溫避光攪拌,反應(yīng)15 min。然后,加入1ml的0.2M乙二醇,室溫下避光輕輕攪拌1 h。用0.2 M的pH9.5碳酸鹽緩沖液G-25凝膠柱洗脫,流速2 ml/min。(2）抗體在透析袋內(nèi)于0.2 M的pH9.5碳酸鹽緩沖液中4℃電磁攪拌透析過(guò)夜。(3）酶與抗體反應(yīng):按照酶與抗體體積之比為1∶9的比例混合,避光攪拌反應(yīng)1 h。加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液,混勻,再置4℃1小時(shí)終止反應(yīng)。(4）準(zhǔn)備G200層析柱[3]:用平衡液沖至平衡。將所得樣品過(guò)柱子,用平衡液沖洗,收集洗脫峰。

2 結(jié)果

用SDS-PAGE測(cè)定,步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

2.1 EPO抗原純化結(jié)果

2.1.1 EPO抗原純化示意圖 見(jiàn)圖1。

圖1 EPO抗原純化

2.1.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 將待測(cè)的純化EPO抗原樣品用PBS做適當(dāng) 5倍稀釋,分別測(cè)定OD280、OD260的值分別為0.87、0.95,設(shè)定稀釋液作為陰性對(duì)照。按照經(jīng)驗(yàn)公式:蛋白質(zhì)濃度=(1.45 OD280-0.74 OD260）×稀釋倍數(shù),即,濃度=1.45×0.87-0.74×0.95=0.56(mg/ml）。

2.1.3 蛋白質(zhì)純度測(cè)定 SDS-PAGE測(cè)定純度。蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量為 14.4 KD、20.0 KD、24.0 KD、35.0 KD、45.0 KD、66.2KD、94.0 KD。在濃縮膠中時(shí),100 V恒壓電泳,待溴酚蘭染料進(jìn)入分離膠后,調(diào)整電壓120V恒壓電泳,直至溴酚蘭遷移至距凝膠下緣1 cm處,停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)染料R250染色,上樣的EPO抗原蛋白在膠上,相對(duì)應(yīng)地在35 KD附近有明顯的不雜亂的條帶。

2.2 EPO抗體的純化結(jié)果

2.2.1 EPO抗體的純化示意圖 見(jiàn)圖2。

圖2 EPO抗體純化示意圖

上圖中,第一個(gè)峰為pH=6洗脫出的,第二個(gè)則為pH=3洗脫出的。我們對(duì)兩者均進(jìn)行收集。分別加入中和液之后,透析濃縮。

2.2.2 抗體蛋白的含量測(cè)定 測(cè)定OD280、OD260的值分別為0.97、1.35,根據(jù)公式:蛋白質(zhì)濃度=(1.45 OD280-0.74 OD260）×稀釋倍數(shù),濃度=1.45×0.97-0.74×1.35=0.41(mg/ml）。

2.2.3 抗體效價(jià)測(cè)定 免疫的兩只家兔血清中EPO抗體效價(jià)為 :1∶15 000,1∶20 000。

2.2.4 特異性鑒定 見(jiàn)表1。

表1 EPO多克隆抗體與 rhEPO、PSA、CEA的反應(yīng)測(cè)定

2.3 酶標(biāo)EPO純化結(jié)果

2.3.1 純化結(jié)果 見(jiàn)圖3。

圖3 HRP標(biāo)記抗體洗脫示意圖

本方法為分子篩凝膠過(guò)濾,洗脫出的第一個(gè)峰是分子量最大的HRP-Ab復(fù)合物,后面的兩個(gè)峰分別是游離的酶和抗體。

2.3.2 酶標(biāo)抗體濃度鑒定

酶量(mg/ml）=OD403×0.4=1.04(mg/ml）。IgG量(mg/ml）=(OD280-OD403×0.3）×0.62=2.306(mg/ml）。摩爾比值(E/P）=mg(酶）4/mg(IgG）=1.80。酶結(jié)合率=OD403/OD280,值為0.578,一般以標(biāo)記率0.30-0.60為合格。

一般認(rèn)為酶量為1 mg/ml摩爾比值在1.5-2.0之間并且酶標(biāo)記率大于0.3時(shí),ELISA結(jié)果最好[5]。

3 討論

現(xiàn)代,基因重組技術(shù)的飛速發(fā)展,將EPO目的蛋白基因插入表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞,在誘導(dǎo)劑條件下,可大量地表達(dá)rhEPO,成本低,表達(dá)量大,已成為制備抗體所用抗原的重要來(lái)源[6]。

本研究采用蛋白A凝膠的親和層析法,效果更佳,免疫親和層析可以達(dá)到很高的純度[7,8],有時(shí)僅一步純化即可達(dá)到純化的目的,將抗體結(jié)合后洗脫,回收率可達(dá)50%以上,和相關(guān)報(bào)道一致[9],不必三步純化,以免導(dǎo)致回收率下降。本研究結(jié)果顯示,蛋白純度較高。

ELISA方法中,檢測(cè)待測(cè)血清中的抗原量時(shí),需要將酶連接在與抗原結(jié)合的二抗上,再通過(guò)酶與底物的顯色反應(yīng)來(lái)表示抗原的濃度。HRP與抗體的結(jié)合需要交聯(lián)劑,常用的交聯(lián)方法是改良過(guò)碘酸鈉法[10]。HRP分子中與酶活性無(wú)關(guān)的糖基被過(guò)碘酸鈉(NaIO4）氧化為醛基,可以與抗體的氨基反應(yīng)形成Shiff鍵。獲得的酶標(biāo)記抗體產(chǎn)率較高,將近70%的HRP與Ig結(jié)合,99%的Ig與HRP結(jié)合,酶與抗體的活性均無(wú)重大損失。

免疫學(xué)檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫檢測(cè)、放射免疫檢測(cè)以及化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè),但是,放射免疫檢測(cè)不可避免的有放射性危害,化學(xué)發(fā)光法儀器價(jià)格昂貴,這些都限制了它們的應(yīng)用,ELISA方法成為較合適的選擇。本研究從rhEPO的純化入手,免疫動(dòng)物制得多克隆抗體,抗體特異性強(qiáng)。本研究制備了酶標(biāo)記抗體,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在純化過(guò)程中,抗原、抗體損失量小,純度較高。完全符合進(jìn)一步構(gòu)建ELISA試劑盒的要求。

[1]Oslawska-Dzierzega A,Dabrowska M,Hrycek E,et al.Selected problems concerning anaemia in systemic lupus erythematosus patients[J].Pol Merkur Lekarski,2009,27(162）:503.

[2]Kato F,Takeuchi N,Takenoshita E,et al.Retardation of hemodialysis by recombinant human erythropoietin in patients with chronic kidney disease[J].Nippon Jinzo Gakkai Shi,2010,52(1）:58.

[3]Karpatkin S,Nardi MA,Hymes KB.Sequestration of anti-platelet GPIIIa antibody in rheumatoid factor immune complexes of human immunodeficiency virus 1 thrombocytopenic patients[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(6）:2263.

[4]沈關(guān)心,周汝麟,主編.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,2002:535-538.

[5]徐順清,劉衡川,主編.免疫學(xué)檢驗(yàn)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:126-127.

[6]Liu X,Wu Y,Li M,et al.Production of polyclonal antibody against interleukin-33 and assessment of its distribution in murine liver and lung[J].J Biomed Biotechnol,2009,2009:729197.

[7]Aizawa P,Winge S,Karlsson G.Large-scale preparation of thrombin from human plasma[J].Thromb Res,2008,122(4）:256.

[8]趙丹慧,王 娜,張 艷,等.人甲狀旁腺激素多肽抗體制備及純化方法研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,29(2）:168.

[9]Gokana A,Winchenne JJ,Ben-Ghanem A,et al.Chromatographic separation of recombinant human erythropoietin isoforms[J].J Chromatogr A,1997,791(1-2）:109.

[10]Sakuma S,Sagawa T,Masaoka Y et al.Stabilization of enzyme-susceptible glucoside bonds of phloridzin through conjugation with poly(gammaglutamic acid）[J].J Control Release,2009,133(2）:125.