杜 靜,杜 玲,宴耀明,周 薇,陸 紅,鄒德學(xué)

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院,廣東深圳 518036;2.襄樊市中醫(yī)院,湖北襄樊 441000）

隨著人們生活質(zhì)量的提高,肥胖癥與高脂血癥的發(fā)病率日趨上升,已危害到人們的身體健康和生活質(zhì)量,其防治成為當(dāng)今亟待解決的問題。肥胖和高脂血癥的主要原因是能量代謝失衡。有研究表明SIK2是一種重要的脂肪組織特異性的能量調(diào)控蛋白,在脂肪細(xì)胞的能量代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。RNA干擾技術(shù)(RNA interfering,RNAi）是近年來迅速發(fā)展起來的生物技術(shù),已成為基因功能研究以及基因治療的強(qiáng)有力工具[2]。實驗以短發(fā)夾(Short hair RNA,shRNA）腺病毒為介導(dǎo),構(gòu)建靶向干擾脂肪細(xì)胞SIK2基因的表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究SIK2的功能提供技術(shù)手段,對于了解SIK2在脂代謝中的作用和調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料3T3-L1細(xì)胞系購自ATCC公司。Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體和 Trizol、Adenoviral RNAi表達(dá)系統(tǒng)試劑盒購自Invitrogen公司。腺病毒純化試劑盒購自Cell Biolabs公司。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、SIK2兔抗鼠抗體、化學(xué)發(fā)光試劑均購自Santa Cruz公司。胰蛋白酶購自Gibco公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(molony murine leukemia virus reverse transcriptase）購自 Promega公司,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF）膜購自Amersham公司,DMEM和胎牛血清購自Gibco公司。SIK2和三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH）PCR引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成,其余試劑均購自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒的設(shè)計 單鏈oligo、引物和探針設(shè)計:參照已發(fā)表的SIK2序列(NM-015191）設(shè)計互補(bǔ)ss oligos和引物,見表1。

表1 單鏈oligo引物設(shè)計

Oligo正義鏈中cgaa序列和反義鏈中ttcg序列為短發(fā)夾RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu),底劃線部分序列為和穿梭質(zhì)粒連接時的接頭設(shè)計。以上序列由Invitrogen公司合成。

1.2.2 構(gòu)建shRNA重組腺病毒 單鏈oligos經(jīng)95℃變性5 min,與Invitrogen公司提供的線性化卡那霉素抗性pENTR/U6載體進(jìn)行連接得到pENTR/U6-sh-RNA-SIK2穿梭質(zhì)粒,轉(zhuǎn)TOP10感受態(tài)菌擴(kuò)增。挑不同單克隆菌送Invitrogen公司測序鑒定。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pENTR/U6-shRNA-SIK2質(zhì)粒進(jìn)入3T3-L1細(xì)胞。Trizol提取總RNA,以三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH）的表達(dá)作為內(nèi)參(相應(yīng)引物的序列見表1）。Real-time RT-PCR篩選最有效RNA干擾pENTR/U6-shRNA-SIK2質(zhì)粒。篩選得到pENTR/U6-shRNASIK2穿梭質(zhì)粒、pENTR/U6-shRNA空質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒pAd/BLOCK-iTTm-DEST進(jìn)行同源重組,氨芐青霉素選擇培養(yǎng)基篩選陽性克隆。以空重組質(zhì)粒作為對照,重組pAd-shRNA-SIK2質(zhì)粒經(jīng)Pacl酶切后,用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染70%貼壁的HEK293A細(xì)胞。收集完全病變培養(yǎng)孔中的細(xì)胞及培養(yǎng)液,-20℃和37℃反復(fù)凍融3次,上清加入293A細(xì)胞中繼續(xù)感染擴(kuò)增腺病毒。經(jīng)多輪感染后獲得高滴度的Ad-shRNA-SIK2重組腺病毒和空載體病毒。

1.2.3 重組腺病毒純化、濃縮和滴度測定 按照試劑盒說明書操作,采用特殊的純化膜從腺病毒粗提取液中特異性吸附病毒顆粒進(jìn)行純化和濃縮。病毒的滴度通過測定游離病毒顆粒的吸光度值進(jìn)行確定(在260 nm處的1個吸光度值相當(dāng)于1012病毒顆粒/ml）。提純后的重組腺病毒濃度可達(dá)到0.5×1012病毒顆粒/ml。

1.2.4 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 3T3-L1細(xì)胞按照常規(guī)的貼壁細(xì)胞方法培養(yǎng)。在細(xì)胞狀態(tài)良好時,傳代分瓶(1×105/ml）,細(xì)胞接觸抑制兩天后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含0.5 mM 3-異丁基-1甲基黃呤、10 μ g/ml胰島素 、0.25 μ M 地塞米松）培養(yǎng)兩天,接著換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含10μ g/ml胰島素）培養(yǎng)兩天,最后改為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng),每兩天換液,直至90%的細(xì)胞為成熟的脂肪細(xì)胞。

1.2.5 Ad-shRNA-SIK2腺病毒載體轉(zhuǎn)染成熟的3T3-L1,Real-time RT-PCR檢測脂肪細(xì)胞中SIK2 mRNA的表達(dá) 脂肪細(xì)胞分別用 2.5×1010、1×1011、2.5×1011純化病毒顆粒/ml Ad-shRNA-SIK2腺病毒和空載體病毒轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞,并以空載體病毒作為陰性對照,更換培養(yǎng)液后在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時后,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,Real-time RT-PCR檢測脂肪細(xì)胞中SIK2 mRNA的表達(dá)。挑選最佳感染病毒濃度。

1.2.6 Western blot分析沉默效果 pAd-shRNA-SIK2重組病毒和對照空載體腺病毒分別感染3T3-L1分化脂肪細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞用PBS洗滌3次,提取總蛋白,按《分子克隆實驗操作指南》取等量蛋白20 g經(jīng)十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE）電泳分離蛋白,然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,一抗分別為SIK2兔抗鼠多克隆抗體和兔抗鼠β-actin多克隆抗體,二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔lgG。用化學(xué)發(fā)光法顯色蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 統(tǒng)計分析 用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s）來表示,組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 pENTR/U6-shRNA-SIK2穿梭質(zhì)粒的測序結(jié)果送3個穿梭質(zhì)粒測序后,證實所設(shè)計ds oligo已經(jīng)正確插入pENTR/U6載體中,位于人u6啟動子和PolⅢ終止子之間。

2.2 pENTR/U6-shRNA-SIK2穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞后,RT-PCR篩選最佳穿梭質(zhì)粒:將構(gòu)建好的3個質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入脂肪細(xì)胞后,第5天用Real-time PCR檢測3T3-L1脂肪細(xì)胞SIK2 mRNA的基因表達(dá),結(jié)果以目標(biāo)基因與GAPDH基因表達(dá)的比值表示,結(jié)果顯示SIK2 shRNA-1,2,3均對SIK2有明顯的抑制作用(P＜0.05）,其中SIK2 shRNA-2對 3T3-L1細(xì)胞SIK2表達(dá)抑制作用最強(qiáng),抑制率為86%(圖1）。

2.3 不同濃度的Ad-shRNA-SIK2腺病毒載體轉(zhuǎn)染成熟的3T3-L1細(xì)胞后,RT-PCR篩選最佳轉(zhuǎn)染濃度:以空載體為對照,Real-time PCR測量三種濃度的2.5×1010、1×1011、2.5×1011純化腺病毒顆粒/ml轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞后的SIK2mRNA的基因沉默效率。結(jié)果顯示三種濃度純化腺病毒顆粒均對成熟的3T3-L1細(xì)胞SIK2 mRNA表達(dá)有明顯的抑制作用(P＜0.05）,其中2.5×1011純化腺病毒顆粒/ml的濃度沉默效率最高,達(dá)到71%(圖2）。

圖1 pENTR/U6-shRNA-SIK2穿梭質(zhì)粒干擾SIK2 mRNA基因表達(dá)效果

圖2 Ad-shRNA-SIK2腺病毒載體干擾SIK2 mRNA基因表達(dá)效果

2.4 Western blot檢測3T3-L1脂肪細(xì)胞Ad-shRNASIK2腺病毒載體的RNA干擾SIK2蛋白表達(dá)效果:用2.5×1011病毒顆粒/ml Ad-SIK2腺病毒轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞經(jīng)蛋白質(zhì)印跡分析,可見感染空載體腺病毒的細(xì)胞分子量約為120 kD的條帶,而感染pAd-SIK2重組病毒的細(xì)胞條帶明顯降低,見圖3。

圖3 Ad-shRNA-SIK2腺病毒干擾SIK2的蛋白表達(dá)

3 討論

肥胖已成為嚴(yán)重危害人類健康的社會問題?，F(xiàn)有大約十億的成年人是超重,其中3億成年人是肥胖。肥胖和超體重是高血壓、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、腦卒中等多種疾病的重要危險因素[3]?？刂品逝?減少機(jī)體脂肪聚集可降低心腦血管等疾病的危險性和發(fā)病率。能量代謝失衡是導(dǎo)致肥胖的根本原因。作為細(xì)胞能量監(jiān)測器,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK,5'AMP activated protein kinase）系統(tǒng)一直密切監(jiān)視著細(xì)胞的能量狀態(tài)。AMPK的活性受AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)。應(yīng)激反應(yīng)可通過ATP的產(chǎn)生減少或利用增加,使細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP的比值增加,從而激活A(yù)MPK。激活的AMPK可激發(fā)一系列的反應(yīng)來恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)的能量平衡。AMPK可啟動分解代謝途徑,如脂肪酸氧化和糖酵解,從而增加ATP的產(chǎn)生,同時關(guān)閉合成代謝途徑,如脂肪酸合成和蛋白合成,減少ATP的消耗[4]。目前AMPK在肌肉和肝臟的能量代謝中的作用有廣泛的研究,有關(guān)AMPK在脂肪組織中的研究較少,作用并不明確。

SIK2是AMPK家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶,相對特異性地在脂肪組織表達(dá)[5]。有文獻(xiàn)報道肥胖或糖尿病老鼠脂肪組織中SIK2的活性升高[6],饑餓時脂肪組織的SIK2表達(dá)顯著升高[1],SIK2可能是脂肪組織能量的代謝重要調(diào)節(jié)因子,起著AMPK樣的能量感受器作用。明確SIK2在體內(nèi)脂肪組織內(nèi)的作用和分子機(jī)制,有助于對肥胖和II型糖尿病脂代謝紊亂的理解和認(rèn)識。本實驗采用RNAi技術(shù),以SIK2為靶基因,設(shè)計三對編碼SIK2shRNA的寡核苷酸鏈,定向克隆至 shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pENTR/U6-shRNA穿梭質(zhì)粒,在3T3-L1細(xì)胞中表達(dá)篩選RNA干擾效率最高的一對SIK2 shRNA-2。通過同源重組,在體外構(gòu)建表達(dá)SIK2 shRNA的腺病毒表達(dá)載體。純化的載體轉(zhuǎn)染到成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞系后,在U6啟動子作用下在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA,轉(zhuǎn)錄體自身折疊形成特異的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)shRNA,在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生發(fā)夾狀的siRNA,進(jìn)而特異性導(dǎo)致SIK2 mRNA降解,長期而有效地沉默了小鼠成熟脂肪細(xì)胞3T3-L1的SIK2蛋白的表達(dá)。本實驗通過腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù),成功轉(zhuǎn)染3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞系,特異性地干擾SIK2 mRNA表達(dá)(71%）,進(jìn)而導(dǎo)致SIK2蛋白的合成明顯減少。SIK2 shRNA腺病毒表達(dá)載體的成功構(gòu)建為進(jìn)一步觀察SIK2基因在脂肪細(xì)胞中的作用和分子機(jī)制,研究SIK2與肥胖的關(guān)系提供了實驗基礎(chǔ)。隨著對SIK2的深入研究,必將促進(jìn)肥胖病脂代謝紊亂的研究發(fā)展,為研究肥胖的基因治療提供新思路。

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