張 敏,王銀萍,倪勁松,薛世泉,鄒亞彬,張麗紅

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長春 130021;2.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院 病理科,吉林 長春 130021）

慢性胰腺炎是一種以胰腺進(jìn)行性炎癥和纖維化為特征,最終引起胰腺結(jié)構(gòu)和功能永久性破壞的疾病,慢性胰腺炎明確診斷20年后往往發(fā)展成為胰腺癌。慢性胰腺炎及胰腺癌病因復(fù)雜,遺傳基因異常在二者發(fā)病中的作用成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn),但目前尚無一致性定論。囊性纖維跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR）及絲氨酸蛋白酶抑制劑 Kazal 1型(Serine protease inhibitor Kazal type 1,SPINK1）,是新近發(fā)現(xiàn)的與慢性胰腺炎及胰腺癌相關(guān)的兩種基因蛋白。CFTR是一種氯離子通道蛋白,調(diào)節(jié)Na--Cl-交換。SPINK1是一種胰蛋白酶抑制劑。國外研究者已發(fā)現(xiàn)CFTR及SPINK1基因突變及多態(tài)性與慢性胰腺炎密切相關(guān)。本研究通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了CFTR及SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達(dá),為慢性胰腺炎及胰腺癌的防治從基因水平上開辟新途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本

慢性胰腺炎石蠟標(biāo)本20例,男性12例,女性8例?；颊吣挲g從 37-75歲,平均年齡為(43.3±11.6）歲。胰腺導(dǎo)管腺癌石蠟標(biāo)本30例,男性20例,女性10例?；颊吣挲g范圍50-75歲,平均年齡為(56±5.6）歲。正常胰腺組織標(biāo)本10例,均為臨床進(jìn)行Whipple手術(shù)切除所帶的胰腺組織,其中男性7例,女性3例,年齡56-73歲,平均年齡(65±5.3）歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師復(fù)查,診斷無誤。

1.1.2 試劑

CFTR及SPINK1單克隆抗體(兔抗人）購于北京吉奧眾藝生物有限公司,SP免疫組化試劑盒和DAB顯色液購于福州邁新生物技術(shù)有限公司,FITC標(biāo)記的熒光二抗購于長春鼎國生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色方法

采用SP染色法免疫組化,實(shí)驗(yàn)步驟按SP試劑盒說明書進(jìn)行,以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判定

CFTR以胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá),每例隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野觀察。采用染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比雙重判定進(jìn)行評(píng)分,并將二者評(píng)分乘積作為最終評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:染色強(qiáng)度判定:基本不著色為0分,著色弱為1分,中度著色為2分,著色強(qiáng)為3分;陽性細(xì)胞比例的判定:著色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比＜10%為0分,10%-25%為1分,26%-50%為2分,51%-75%為3分,＞75%為4分。最后以陽性細(xì)胞的百分比得分和染色強(qiáng)度得分乘積做為最終結(jié)果進(jìn)行判定。0分為陰性(-）,1-4分為弱陽性(+）,5-8分為陽性(++）,9-12分為強(qiáng)陽性(+++）,本文中所統(tǒng)計(jì)陽性率以+-+++作為陽性計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 CFTR蛋白的表達(dá)

正常胰腺對(duì)照組中幾乎所有的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞均可見陽性表達(dá),陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,少數(shù)定位于胞膜,為棕黃色細(xì)顆粒狀(圖1）,陽性率為100%。部分慢性胰腺炎中胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞可見表達(dá),陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖2）。陽性表達(dá)率為50%。胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞中偶見表達(dá)(圖3,圖4）,陽性表達(dá)率為10%。結(jié)果顯示,慢性胰腺炎及胰腺癌組表達(dá)結(jié)果均低于正常對(duì)照組,經(jīng) χ2檢驗(yàn),P＜0.05,組間差異顯著;胰腺導(dǎo)管癌組明顯低于慢性胰腺炎組(P＜0.05）(見表1）。

圖1 CFTR在正常胰腺組織中呈陽性表達(dá)400×

表1 CFTR在正常胰腺組織、慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達(dá)

2.2 SPINK1蛋白的表達(dá)

正常胰腺對(duì)照組中在幾乎所有的胰腺腺泡細(xì)胞及胰管上皮內(nèi)均可見陽性表達(dá),SPINK1的陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖5）,陽性率為100%。慢性胰腺炎組織中腺泡細(xì)胞及胰腺導(dǎo)管細(xì)胞的胞質(zhì)可見表達(dá)(圖6）,陽性率為55%。胰腺癌細(xì)胞中偶見表達(dá),主要定位于細(xì)胞核(圖7,8）,陽性率為6.7%。結(jié)果顯示,慢性胰腺炎及胰腺癌組表達(dá)結(jié)果均低于正常對(duì)照組,經(jīng) χ2檢驗(yàn),P＜0.05,組間差異顯著;胰腺導(dǎo)管癌組明顯低于慢性胰腺炎組(P＜0.05）詳見表2。

圖3 CFTR在高分化胰腺癌中呈弱表達(dá)400×

圖4 CFTR在低分化胰腺癌中呈弱表達(dá)400×

圖5 SPINK1在正常胰腺組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)400×

圖6 SPNK1在慢性胰腺炎中呈弱陽性表達(dá)400×

圖7 SPINK1在高分化導(dǎo)管癌中呈弱表達(dá)400×

圖8 SPINK1在低分化胰腺導(dǎo)管癌中呈弱表達(dá)400×

表2 SPINK1蛋白在正常胰腺,慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達(dá)

3 討論

CFTR是分布于胰腺、腸道及膽管等部位上皮細(xì)胞游離膜上的一種氯離子通道,它在跨上皮鹽類的轉(zhuǎn)運(yùn)、水份流動(dòng)和離子濃度調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1-3]。異常CFTR可能導(dǎo)致經(jīng)由上皮層的液體轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生改變[4],細(xì)胞無法進(jìn)行正常分泌活動(dòng),導(dǎo)致水分流失和分泌物粘稠,從而引起局部組織的阻塞和感染。

SPINK1又稱胰分泌性胰蛋白酶抑制劑Kazal 1型,正常狀態(tài)下,SPINK1-胰蛋白酶復(fù)合物一起分泌入胰管,到達(dá)小腸后SPINK1分離或降解,胰蛋白酶抑制解除[5]。眾所周知,胰腺炎的發(fā)生與胰蛋白酶原的異常激活有關(guān),所以SPINK1蛋白在胰腺炎發(fā)病過程中可能充當(dāng)?shù)氖菍?duì)抗激活的胰蛋白酶原的第一線保護(hù)機(jī)制[6]。

3.1 CFTR蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中的表達(dá)及其意義

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CFTR蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中呈弱表達(dá),明顯弱于正常的胰腺組織。可見CFTR蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中表達(dá)丟失,這種表達(dá)異?？赡芘c二者的發(fā)生及發(fā)展存在著一定關(guān)系。由于CFTR功能不全,離子分泌障礙,導(dǎo)致分泌液PH值下降。酸性環(huán)境在引起組織炎癥損害的同時(shí),還會(huì)導(dǎo)致胰酶分泌及激活的異常,最終導(dǎo)致胰腺的纖維化及功能不全[7]。Smith[8]認(rèn)為較低離子濃度是機(jī)體保持消滅微生物能力的一個(gè)重要因素,而CFTR表達(dá)異常時(shí)氯化鈉濃度較高,機(jī)體清除病原體能力下降,這也是機(jī)體感染的一個(gè)重要原因。推測(cè)CFTR蛋白表達(dá)異常時(shí),分泌的胰液濃縮而阻塞胰腺導(dǎo)管使其抗感染能力下降,最終導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生。CFTR蛋白的缺失改變了胰腺細(xì)胞內(nèi)的PH值,而PH值的變化又影響細(xì)胞的分化增殖及細(xì)胞周期[9]。

3.2 SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達(dá)及其意義

本實(shí)驗(yàn)中SPINK1蛋白在慢性胰腺炎組中的表達(dá)顯著低于正常胰腺組,提示由于SPINK1蛋白表達(dá)的降低,失去了對(duì)胰蛋白酶的抑制作用而導(dǎo)致胰腺炎癥的發(fā)生,這與Witt等[10]研究的SPINK1基因突變與慢性胰腺炎相關(guān)性的結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示,SPINK1蛋白在胰腺癌中的表達(dá)顯著低于正常胰腺組及慢性胰腺炎組。表達(dá)部位及強(qiáng)度的改變,提示SPINK1蛋白的異常表達(dá)可能參與了慢性胰腺炎向胰腺癌的發(fā)展過程。推測(cè)在慢性胰腺炎向胰腺癌的發(fā)展過程中,SPINK1蛋白可能是作為一種致病因子或一種修飾因子,降低了胰腺癌發(fā)病的閾值或是與其他的基因蛋白一起促進(jìn)了胰腺癌的發(fā)生,也可能由于細(xì)胞發(fā)生癌變導(dǎo)致SPINK1蛋白表達(dá)部位及強(qiáng)度的變化。

綜上所述,通過對(duì)CFTR和SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達(dá)情況分析,推測(cè)兩種蛋白表達(dá)的異常與慢性胰腺炎及胰腺癌的發(fā)生有一定關(guān)系,亦可能是作為一種附加因素與其他致病因素共同作用導(dǎo)致慢性胰腺炎及胰腺癌的發(fā)生。本次研究為胰腺疾病復(fù)雜病因的探索開拓了新思路,隨著研究的深入必將進(jìn)一步明確胰腺疾病的病因,為胰腺炎及胰腺癌診斷、防治提供新的策略。

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