文京華，李伯塤，黃小平，江衛(wèi)紅，朱彥菲，李武縣

(1深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院，廣東深圳518049;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院;3深圳市人民醫(yī)院)

外陰鱗狀細(xì)胞癌(VSCC)是較少見的惡性腫瘤，多見于60歲以上婦女，其病因及發(fā)病機制尚未完全明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，表觀調(diào)控機制在腫瘤的發(fā)生機制中起重要作用。為探討VSCC的發(fā)病機理，我們檢測了VSCC患者癌組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、Bcl-2基因啟動子的甲基化及其表達?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006年1月～2011年1月在深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院和西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院行手術(shù)治療的8例VSCC患者，年齡(43.5±9.6)歲;均經(jīng)病理檢查證實，其中高分化3例，中分化2例，低分化3例;有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各4例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期5例，Ⅲ～Ⅳ期3例?；颊呔唇邮苓^放、化療。

1.2 檢測方法 取8例患者的癌組織及毗鄰正常皮膚組織(正常組織)手術(shù)標(biāo)本，檢測其VEGF、Bcl-2基因啟動子的DNA甲基化及其表達。

1.2.1 DNA甲基化免疫共沉淀—實時定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測DNA甲基化 參考文獻［1］方法，并進行部分改良。即取VSCC及正常組織各25 mg，在液氮中用BioPulverizer粉碎機破碎，抽提DNA;用超聲處理細(xì)胞懸液4 min，破碎后，取部分檢測破碎效率，確定基因組DNA片段為200～1 000 bp。向超聲后的各EP管中加入稀釋緩沖液，使其體積均為700 μl，再加入蛋白 G 磁珠懸液 60 μl，4 ℃、垂直混勻器上混勻1 h;將上述EP管置于磁力架中，放置10 min以上，溶液完全澄清后，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中;加熱95℃、10 min后，加入5-甲基胞嘧啶抗體8 μg，4℃、垂直混勻器上孵育過夜;加入偶聯(lián)二抗兔抗IgG磁珠，4℃、垂直混勻器上孵育2 h;分別用預(yù)冷的三種溶液各1 ml，在4℃下依次洗滌Protein G-抗體-DNA復(fù)合物，洗完后將EP管放到磁力架上，放置10 min，直至磁珠全部被吸附到管壁上，上清澄清后棄上清;用洗脫液(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、1%SDS)400 μl洗滌，向洗脫的MeDIP DNA中加入等體積酚—氯仿溶液抽提DNA。

采用ABI 7700 Realtime PCR儀對免疫沉淀的DNA、未加5-甲基胞嘧啶抗體和偶聯(lián)二抗磁珠的DNA、陰性對照進行擴增;測定標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，用2－△△CT法進行分析。實時定量PCR反應(yīng)體系及擴增條件:PCR 反應(yīng)體積25 μl，含10 × buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2溶液 1.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μl，10 μmol/L特異性上下游引物各1 μl(上海生工公司合成)，10 ×Sybergreen 工作液 0.625 μl，Taq 酶 1 U，DNA模板1 μl。擴增條件為:預(yù)變性95℃ 4 min，94 ℃ 10 s，59 ℃ 15 s，81 ℃ 15 s，共40個循環(huán)?；驍U增引物序列為:VEGF F:5'AGTAAGAGTTT TAGAGAGAAGTCGA3'，R:5'AACGATATCTATCTATCTATCCGTC3';Bcl-2 F:5'TATTATAAGTTGTCG TAGAGGGGTTAC3'，R:5'CGACTAAATAAAACGTATACCCGAA3'。

1.2.2 實時定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR 采用 Trizol抽提RNA，瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA質(zhì)量，紫外分光光度計測定A260/A280比值;鑒定RNA純度及定量后，將合格的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，4℃保存待用。采用Prime5.0統(tǒng)計軟件分析設(shè)計引物序列及管家基因GAPDH(略)，熒光定量PCR反應(yīng)體系及擴增條件與MeDIP-qPCR相同。測定標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，用2－△△CT法［2］進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織的VEGF、Bcl-2甲基化改變 VSCC患者癌組織的VEGF、Bcl-2基因甲基化分別為0.71±0.03、0.76±0.05，正常組織分別為0.98±0.02、1.04±0.03;癌組織的 VEGF、Bcl-2 甲基化程度均低于正常組織(P均＜0.05)。

2.2 不同組織的VEGF、Bcl-2 mRNA表達 VSCC患者癌組織的VEGF、Bcl-2 mRNA表達分別為2.58±0.04、1.01±0.03，正常組織分別為 2.31±0.02、0.96±0.03;癌組織的 VEGF、Bcl-2 mRNA 表達均高于正常組織(P均＜0.05)。

3 討論

DNA甲基化是目前研究的熱點之一，最近大量研究顯示，DNA甲基化異常參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2，3］。腫瘤血管生成受多種血管生成因子和血管生成抑制物調(diào)控，VEGF是其中心調(diào)控因子。VEGF是一種高度保守的糖蛋白，能直接促進血管生成，增強血管內(nèi)皮細(xì)胞表達黏附分子，通過纖維蛋白溶解酶系統(tǒng)及金屬蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移［4］。Bcl-2基因是細(xì)胞凋亡抑制基因，其編碼產(chǎn)物Bcl-2蛋白可抑制細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞增殖與凋亡動態(tài)平衡的調(diào)控。本研究顯示，VSCC患者癌組織的VEGF、Bcl-2基因啟動子呈DNA低甲基化，且低甲基化的 VEGF、Bcl-2 mRNA表達增加。VEGF mRNA高表達可促進VSCC的癌組織血管生成，有利于VSCC生長、轉(zhuǎn)移;Bcl-2 mRNA高表達可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，促進VSCC的癌組織細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究認(rèn)為VEGF、Bcl-2基因啟動子DNA低甲基化可能參與VSCC的發(fā)生、發(fā)展，其DNA甲基化改變可能可作為VSCC潛在的生物標(biāo)記物及其表觀治療靶點。

［1］Pulmke N，Santacruz D，Walter J.Comprehensive analysis of DNA-methylation in mammalian tissues using MeDIP-chip［J］.Methods，2011，53(2):175-184.

［2］Watanabe Y，Maekawa M.Methylation of DNA in cancer［J］.Adv Clin Chem，2010，52:145-167.

［3］Huang L，F(xiàn)rampton G，Liang LJ，et al.Aberrant DNA methylation profile in cholangio-carcinoma［J］.World J Gastrointest Pathophysiol，2010，15(2):23-29.

［4］Fondevila C，Metges JP，F(xiàn)oster J，et al.p53 and VEGF express ion are independent predictors of tumour recurrence and survival following curative resection of gastric cancer［J］.Br J Cancer，2004，90(1):206-215.