丁忠陽

(無錫市人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214023)

腦水腫是由于各種致病因素導致的過多水分積聚在腦細胞內或細胞外間隙，引起腦容積增大。創(chuàng)傷性腦損傷是造成腦水腫最常見原因，可進一步引起顱內壓升高，危及患者生命，是神經外科需要解決的一大難題［1，2］。近年研究表明，腦組織中水通道蛋白4(AQP4)參與了神經系統(tǒng)疾病導致的腦水腫形成，而且在病理過程中產生的大量氧自由基對腦水腫形成也起至關重要作用［3］。依達拉奉作為抗氧自由基類藥物是治療腦水腫的常用藥物。2010年1～6月，本研究通過觀察創(chuàng)傷性腦水腫大鼠不同時間腦組織AQP4的水平，探討依達拉奉對腦水腫大鼠AQP4表達是否具有調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠75只(雄性，體質量200～250 g，購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心);Trizol試劑盒購自Invitrogen公司;依達拉奉注射液購自南京先聲東元制藥。

1.2 模型建立及分組 75只大鼠隨機分成對照組、模型組和治療組，每組25只。每組分為5個亞組，每個亞組5只。模型組及治療組均根據(jù)Feeney等方法，首先使用水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠并預留心導管。然后將大鼠固定在立體定位架上，將頭部去毛暴露出頭皮，常規(guī)局部消毒后，無菌條件下切開頭皮，暴露左頂骨。用牙鉆于矢狀縫左旁開2 mm、冠狀縫后1 mm處鉆一直徑約為2 mm孔，逐步擴大形成直徑約6 mm的骨窗，暴露硬腦膜。爾后，將撞擊裝置的撞桿頭端置于骨窗處，將撞擊錘從30 cm高度自由落下，撞擊撞桿，建立重度顱腦損傷模型，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮［4］。對造模大鼠進行觀察，確定造模成功后，治療組大鼠腹腔注射3 mg/kg依達拉奉溶液，每12 h注射一次，連續(xù)治療5 d;模型組大鼠僅給予等量生理鹽水。對照組大鼠給予假手術處理:如上述操作對顱骨開窗，暴露硬腦膜，但不進行撞擊，然后骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，僅給予等量的生理鹽水。分別于給藥治療后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d 處死各組大鼠，開顱取出腦組織。以損傷部位為中心，將腦組織平均分成兩份，稱質量后置于液氮中備用。

1.3 腦含水量測定 取各時間點大鼠腦組織一份，于100℃恒溫箱中干燥至恒重后，計算腦組織中的含水量，比較各時間點大鼠腦含水量的變化。

1.4 腦組織AQP4 mRNA的測定 取各時間點大鼠腦組織一份，在無菌條件下按照Trizol試劑盒說明書中方法提取腦組織總RNA，測定RNA含量;然后采用反轉錄試劑盒制備cDNA并進行PCR擴增。根據(jù)文獻方法設計引物［5］:上游序列5'-TTGGACCATCATAGGCGC-3'，下 游 序 列 5'-GCATGTTGATCGACATTGACC-3'，擴增片段長 214 bp。PCR擴增程序:92℃變性2 min，56℃退火40 s，72℃延伸2 min，反應30個循環(huán)。產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，測定目的基因和內參GAPDH條帶的光密度值，計算AQP4 mRNA表達的水平，比較各時間點大鼠腦組織AQP4 mRNA水平的變化。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，結果用表示，比較采用q檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型大鼠觀察 造模成功后，模型組挫裂傷灶處、蛛網(wǎng)膜下腔、皮質表面出現(xiàn)不同程度出血，隨著時間延長出血癥狀持續(xù)加重，腫脹明顯。3 d后，出血開始緩慢吸收，腫脹逐步減輕。治療組出血及腫脹改善情況優(yōu)于模型組，出血量較少，腫脹程度較輕，1 d后出血開始被吸收，腫脹減輕，3 d后充血水腫得到明顯改善。

2.2 三組不同時間腦組織含水量變化 見表1。

2.3 三組不同時間腦組織AQP4 mRNA水平變化見表2。

3 討論

表1 三組不同時間腦組織含水量變化(%，)

表1 三組不同時間腦組織含水量變化(%，)

注:與對照組同時間相比，*P＜0.05;與模型組同時間相比，△P＜0.05

組別 n 6 h 12 h 1 d 3 d 5 d對照組 5 63.28 ±1.43 64.82 ±1.21 63.87 ±1.09 65.79 ±0.98 64.77 ±1.56模型組 5 70.43 ±1.87* 74.61 ±1.45* 77.86 ±1.85* 80.95 ±2.75* 79.49 ±2.90*治療組 5 68.49 ±1.44* 69.55±2.01＊△ 69.21 ±2.68＊△ 66.31±2.34△ 64.38 ±2.69△

表2 三組不同時間腦組織AQP4 mRNA表達(光密度比值，)

表2 三組不同時間腦組織AQP4 mRNA表達(光密度比值，)

注:與對照組同時間相比，*P＜0.05;與模型組同時間相比，△P＜0.05

組別 n 6 h 12 h 1 d 3 d 5 d對照組 5 0.783 ±0.067 0.769 ±0.081 0.772 ±0.063 0.786±0.081 0.794 ±0.093模型組 5 1.452 ±0.123* 1.573 ±0.141* 1.891 ±0.088* 1.804 ±0.213* 1.785 ±0.154*治療組 5 1.265±0.154＊△ 1.195±0.162＊△ 1.107±0.153＊△ 0.856±0.095＊△ 0.815 ±0.099△

近年來，AQP4對腦水腫形成的影響一直是研究熱點。AQP4是一類具有同源四聚體結構組成的膜通道蛋白家族，主要分布于腦表面的軟腦膜、腦室系統(tǒng)的室管膜，特別是在與腦毛細血管緊密接觸的膠質細胞和星形膠質細胞足突上高水平表達，為膠質細胞與腦脊液和血管間水分的轉運和調節(jié)構建重要結構基礎［1，5］。研究表明，腦組織中AQP4很可能是腦脊液重吸收以及腦水腫形成的分子生物學基礎，而且腦出血后產生的大量氧自由基對腦水腫的形成也起著重要作用，這預示了AQP4膜蛋白與氧自由基之間可能存在某種聯(lián)系。

新型自由基清除劑——依達拉奉在體內以陰離子形式存在，通過轉移電子給自由基而發(fā)揮清除自由基和打斷脂質過氧化反應鏈的作用，可抑制腦血管內皮細胞以及腦神經細胞的過氧化。藥理研究已證實，依達拉奉能減輕各種模型動物腦缺血引起的腦水腫及組織損傷，保護作用明顯［1］。本研究結果顯示，依達拉奉可以明顯降低創(chuàng)傷性腦水腫大鼠腦組織含水量以及AQP4 mRNA表達水平;治療組大鼠各時間點水腫程度較模型組均有所降低，強度減弱;且連續(xù)給予依達拉奉治療5 d后，腦組織含水量降為正常水平，比模型組大鼠降低約15%;腦組織AQP4 mRNA表達也接近正常水平，此時模型組大鼠的腦組織AQP4 mRNA表達水平是治療組大鼠的一倍。其機制可能是依達拉奉有效阻斷腦組織中自由基反應，減弱蛋白激酶C的磷酸化過程，抑制AQP4的表達上調，從而減輕腦水腫形成。

［1］湯崇輝，劉偉國.水通道蛋白4與創(chuàng)傷性腦水腫研究進展［J］.浙江創(chuàng)傷外科，2009，l4(1):84-86.

［2］陳壘，劉躍亭，段虎斌，等.小劑量多巴胺對大鼠顱腦創(chuàng)傷后水通道蛋白4表達的影響［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2009，7(11):1319-1321.

［3］孫彬，衣服新，張樹恒.依達拉奉對大鼠腦出血后水通道蛋白4及血腦屏障的影響［J］.遼寧醫(yī)學院學報，2007，28(6):35-38.

［4］Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT，et al.Responses to cortical injury:Methodology and local effects of contusions in the rat［J］.Brain Res，1981，211(1):67-77.

［5］King LS，Agre P.Pathophysiology of the aquaperin water channels［J］.Annu Rev Physiol，1996，58(6):619-622.