王紅梅，洪 靜，羅文利，常建航，姚曉光，李南方

1新疆醫(yī)科大學 研究生院，烏魯木齊 830054

2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓診療研究中心 新疆高血壓診療研究中心，烏魯木齊 830001

超重、肥胖是高血壓、糖尿病、冠心病等心血管相關疾病的重要危險因素，目前認為是由基因和環(huán)境等因素相互作用引起的。研究表明，人體脂肪容量的變異約有40%歸因于遺傳因素［1-2］。神經前體細胞表達發(fā)育調控樣蛋白4(neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-like，NEDD4L)是泛素-蛋白酶體途徑的重要組成部分，可能參與了肥胖的發(fā)生、發(fā)展過程［3-5］。近年來，一些研究也證實了NEDD4L的rs3865418多態(tài)性與白人、黑人和中國漢族人群的高血壓相關［6-9］。但上述研究還發(fā)現rs3865418多態(tài)性的T等位基因與希臘白人的高血壓發(fā)病相關，而C等位基因與美國白人的高血壓發(fā)病相關，即是所謂的“反轉” (flip-flop)現象，提示在一個人群中是高危致病因素的等位基因，在另一個人群中反而是保護性因素［8］。主要居住在新疆牧區(qū)的哈薩克人是肥胖高發(fā)民族［10］;此外，由于該民族極少與外界通婚，至今仍保留有相對完整的隔離人類遺傳體系，是研究肥胖等多基因復雜疾病的理想人群。目前，rs3865418多態(tài)性與該民族肥胖的關聯研究相關報道較少，因此，本研究采用TaqMan PCR法對該基因的rs3865418多態(tài)性在哈薩克族自然人群中進行分型，分析其與哈薩克族肥胖的相關性，從遺傳學角度探討肥胖的易感機制，以期為肥胖的防治提供參考依據。

對象和方法

對象 采用多級隨機抽樣的方法，對阜康地區(qū)有本地正式戶口、30～60歲、三代內無異族通婚史的長住哈薩克族居民進行流行病學現況調查。調查前事先登記人口，保證應答率，保證入選個體均為無關個體，最后共有856例 (男性364例、女性492例)入選本研究。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究通過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查并同意實施。

方法 以自然人群橫斷面流行病學調查為基礎的病例-對照研究。采用問卷調查方法，調查工作主要由經過統(tǒng)一培訓的、精通哈薩克薩克語的專職人員填寫表格、詢問病史、體格檢查。所有研究對象均收集一般資料，包括性別、年齡、腰圍、收縮壓、舒張壓等。每位研究對象均抽取空腹狀態(tài)下全血5 ml，現場離心分離血清和血液有形成份，血清在采血后1個月內檢測血脂等生化指標，血液有形成份在－80℃保存，以提取DNA。生化檢測均在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 (三級甲等醫(yī)院)檢驗科完成并由專人負責。按《中國成人超重和肥胖癥預防控制指南》［11］標準診斷中心性肥胖，即男性腰圍≥85 cm、女性腰圍≥80 cm者為中心性肥胖，按此標準，856例研究對象中肥胖組共478例、對照組共378例。

哈薩克族人外周血基因組DNA提取 采用PAXgene Blood DNA試劑盒 (QIAGEN，Hilden，Germany)，并按照試劑盒中提供的“操作說明”中的標準操作步驟提取研究對象的外周血基因組DNA。

哈薩克族人群中基因分型 采用Taqman PCR技術，使用 ABI 7900HT(Applied Biosystems，Foster City，California，USA)對856例研究對象進行基因分型。PCR的反應體系:總體積25 μl，其中人類Taq-Man基因多態(tài)性分型預混液 (Applied Biosystems，Foster City，California，USA)12.5 μl、單核苷酸多態(tài)性分型探針/引物預混液 (Applied Biosystems，Foster City，California，USA)1.25 μl、DNA 模板 (20 ng/μl)2 μl、去離子水 9.25 μl。反應條件:預變性 (95℃、10 min、1個循環(huán))，變性 (92℃、15 s)+退火 (60℃、1 min)+延伸 (72℃、1 min)43個循環(huán)，總延伸(72℃、7 min、1個循環(huán))。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0(SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA)統(tǒng)計軟件包進行數據處理。計量資料用均數±標準差表示，計數資料采用百分數表示。組間臨床表型計量資料比較采用t檢驗 (兩組間)或單因素方差分析 (三組間)，分類資料采用卡方檢驗。由基因型頻率計算等位基因頻率，Hardy-Weinberg平衡檢驗、兩組間等位基因頻率和基因型頻率比較采用專業(yè)的遺傳學分析軟件SNPAlyze Ver.7.0.1 pro(日本)進行分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

基因分型 對rs3865418多態(tài)性在851例哈薩克族自然人群中成功進行了基因分型，另有5例分型未成功，基因分型的讀取率99.4%，重復檢測一致率100%。肥胖組、對照組的基因型、等位基因頻率分布均符合 Hardy-Weinberg平衡 (肥胖組 χ2=0.743，P=0.389;對照組 χ2=0.173，P=0.967)。

臨床特征 與對照組比較，肥胖組的平均年齡、收縮壓、舒張壓、腰圍、總膽固醇、三酰甘油水平增高，且差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);但兩組間吸煙、飲酒者比例的差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)(表1)。

rs3865418多態(tài)性與哈薩克族人肥胖的相關性

在總體、男性、女性哈薩克族自然人群中，rs3865418多態(tài)性的基因型 (包括累加模型、顯性模型和隱性模型)、等位基因在肥胖組及對照組分布差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)(表2)。在總體哈薩克族自然人群中，C/C、C/T、T/T 3種基因型攜帶者的腰圍差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05);男性腰圍平均水平有C/C攜帶者＞C/T攜帶者＞T/T攜帶者的趨勢，而女性腰圍平均水平有C/C攜帶者＜C/T攜帶者＜T/T攜帶者的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)(表3)。

表1 肥胖組及對照組臨床資料比較Table 1 Basic characteristics of subjects in obesity group and normal control group

表2 rs3865418多態(tài)性基因型、等位基因在肥胖組及對照組間分布頻率 (n)Table 2 Genotype and allele distributions of rs3865418 polymorphism in obesity group and normal control group(n)

表3 不同基因型腰圍的比較 (，cm)Table 3 Comparing of waist circumference between different genotypes(，cm)

表3 不同基因型腰圍的比較 (，cm)Table 3 Comparing of waist circumference between different genotypes(，cm)

基因型Genotypes 總體Total 男性Male 女性Female C/C 84.09±11.619 88.54±11.775 80.39±10.119 C/T 83.54±12.425 87.51±12.615 80.72±11.510 T/T 84.78±12.581 86.19±12.308 83.89±12.743 P 0.572 0.471 0.050

討 論

泛素-蛋白酶體途徑是真核生物內主要的蛋白質降解系統(tǒng) (70%～80%)。除此之外，該系統(tǒng)也介導、調節(jié)核因子κB的激活過程［3］。核因子κB是重要的炎性轉錄因子并控制白介素-6、白介素-8、腫瘤壞死因子-a等炎性細胞因子及一些黏附因子的轉錄過程［4］。研究表明非特異性系統(tǒng)性炎癥在肥胖的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［5］。因此，泛素-蛋白酶體途徑可能參與肥胖的發(fā)病過程。除泛素外，泛素-蛋白酶體途徑還包括4種酶家族:泛素活化酶、泛素結合酶、泛素蛋白連接酶及蛋白酶體，它們均以多種異構體形式存在。NEDD4L是泛素蛋白連接酶家族成員，故從其生理功能角度來看，NEDD4L是肥胖的候選基因。

本研究證實rs3865418多態(tài)性可能與新疆哈薩克族自然人群中心性肥胖不相關。但是本研究這個陰性研究結果并不是因為檢驗效能不足所導致的 (本研究檢驗效能為0.962)。此外，關聯研究中的假陰性結論的主要原因是受混雜因素的干擾。在諸多混雜因素中，一個極其重要但又常被忽視的因素即是群體的遺傳分層現象，這往往由于遺傳背景不一的亞人群混合所致，其產生機制復雜，可能與各亞人群祖先的遷移模式、婚配習慣、生殖強弱及基因組的隨機突變等因素有關。群體分層對遺傳關聯分析的直接影響是可能導致結果偏倚，產生假陰性的結果。正因如此，很多關聯研究的結果難以在不同人群的研究中得到重復。因此在進行病例對照的關聯研究時，盡可能排除群體分層的干擾尤為重要，如加大樣本量并盡可能的選擇一個遺傳上相對均質的群體等。本研究樣本均來自于一個遺傳上相對均質的相對隔離群體，研究樣本量較大，而且該人群中rs3865418多態(tài)性的基因型、等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡，因此本研究結論是相對可信的。但在今后的研究中尚需要進一步擴大樣本量及在其他民族人群中驗證。

本研究雖然未顯示rs3865418多態(tài)性與哈薩克族人群肥胖相關，但是顯示男性腰圍平均水平有C/C攜帶者＞C/T攜帶者＞T/T攜帶者的趨勢，而女性腰圍平均水平有C/C攜帶者＜C/T攜帶者＜T/T攜帶者的趨勢，盡管上述差異無統(tǒng)計學意義，但也提示在新疆哈薩克族人群中rs3865418多態(tài)性可能存在不同性別間的“反轉” (flip-flop)現象，因此尚需要擴大樣本量進一步研究。既往的研究發(fā)現NEDD4L的rs3865418多態(tài)性與高血壓的關聯存在“反轉”(flip-flop)現象［6-9］，即在一個人群中是高危致病因素的等位基因，在另一個人群中反而是保護性因素［8］。分析其原因可能是 rs3865418多態(tài)性變異位于NEDD4L的內含子區(qū)，因其并未引起編碼氨基酸的改變而不是傳統(tǒng)意義上的“致病突變”，故其與疾病是否相關可能是取決于該變異是否與其他與疾病相關的功能性變異間存在連鎖不平衡:即在某一人群中當其T等位基因與致病變異連鎖時，可以表現為致病因素;當與保護性變異連鎖時，表現為保護性因素;當與功能性變異不連鎖時，表現為與疾病不相關;因此尚需要進一步深入研究位于此位點周圍的、可能與其存在連鎖不平衡關系的NEDD4L變異及周圍其他基因的變異與疾病的關系。

綜上，本研究通過探討NEDD4L變異與哈薩克族人群肥胖的關系，發(fā)現rs3865418多態(tài)性可能與哈薩克族人群肥胖不相關。在此后的研究中，尚需擴大樣本量及在其他民族人群中驗證，并且此位點周圍的其他的NEDD4L變異及周圍其他基因的變異與肥胖的關系尚需要進一步研究。

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