王振全，羅寶正，薄清如，徐海聶，沙才華，廖秀云，陳偉生

(1.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062；2.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局國家外來病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東珠海519015)

H5亞型禽流感病毒(Avian influenza virus serotype H5， AIV-H5)、狂犬病病毒(Rabies virus，RV)、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis2)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸桿菌O157(Escherichia coliO157)6種動(dòng)物源性人獸共患傳染病病原給人們的健康和生活造成了很大的危害。但是目前對(duì)于上述病原的檢測(cè)多以一種或少數(shù)幾種細(xì)菌或病毒為主，很少將人獸共患的細(xì)菌和病毒同時(shí)檢測(cè)。在進(jìn)出境口岸檢驗(yàn)過程中對(duì)冷凍肉類及蛋類制品往往要求多個(gè)項(xiàng)目同時(shí)進(jìn)行，可能同時(shí)涉及到檢驗(yàn)多種細(xì)菌和病毒。在這種情況下，傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方式難以滿足快速、精確的檢驗(yàn)要求。

基因芯片是具有高通量、集成化、微型化、自動(dòng)化并且快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)[1-3]、細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)與藥物篩選[4]、基因多態(tài)性和基因突變分析[5-7]、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)[8-9]等領(lǐng)域。本研究根據(jù)基因芯片核酸分子雜交的原理，建立一種可同時(shí)檢驗(yàn)上述6種病原體的快速、靈敏、特異的基因芯片方法，為口岸檢測(cè)及工商執(zhí)法提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 病毒株和菌株 H5N1 AIV滅活病毒株購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；RV、甲型H1N1流感病毒、犬瘟熱病毒(CDV)和犬細(xì)小病毒(CPV)均為疫苗毒；S.suis2滅活抗原購自江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局；Salmonella、大腸桿菌E.coliO157、志賀氏菌(Shigella)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)、H4N6和H6N2 AIV株由珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局分離保存；炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)的陽性模板使用合成DNA的克隆菌。

1.2 主要試劑和儀器 DNA/RNA磁珠提取試劑盒購自深圳易瑞生物技術(shù)有限公司；One Step RT-PCR Kit、PCR Amplification Kit、DL Mark 2000 購自寶生物工程(大連)有限公司；生物芯片反應(yīng)儀系統(tǒng)購自臺(tái)灣晶宇公司。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157的保守基因序列，利用Clustal X比對(duì)，利用Primer Express 2.0設(shè)計(jì)特異性引物和探針。在上游引物的5'端標(biāo)記生物素Biotin，在探針的5'端連接Poly(T)，由上海超世生物科技公司合成(表1)。

1.4 6種病原PCR產(chǎn)物的制備 用磁珠法提取6種病原的核酸，利用上述引物，對(duì)AIV-H5和RV進(jìn)行One Step RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為 50℃ 30 min；94℃ 3 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。對(duì)S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157擴(kuò)增時(shí)使用PCR Amplification Kit，體系為50 μL，反應(yīng)條件為 94℃ 3 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃40 s、35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.5 芯片的制備 將合成的探針用探針稀釋液調(diào)整濃度至40 μmol/L，進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣矩陣見表2，點(diǎn)樣后室溫干燥10 min，在紫外交聯(lián)儀固定(254 nm，1.2 J，7 min～13 min)，Milli-Q水洗滌3次，95%乙醇浸潤(rùn)20 s，50℃干燥10 min。以Poly(T)-Biotin為陽性對(duì)照，探針稀釋液為空白對(duì)照，與本研究中各靶基因沒有任何同源性的植物葉綠素的基因?yàn)殛幮詫?duì)照。

表1 引物和探針Table 1 Primers and probes

表2 探針點(diǎn)樣示意圖Table 2 Distribution dots of the microarray

1.6 芯片雜交溫度優(yōu)化試驗(yàn) 取6種病原的PCR產(chǎn)物各 10 μL與 200 μL的 DR.雜交緩沖液充分混合，沸水變性6 min，轉(zhuǎn)移至冰上10 min；將上述混合物轉(zhuǎn)移至芯片室內(nèi)，平鋪均勻，分別在45℃、47℃、49℃、51℃溫度下雜交45 min～60 min，選擇最佳雜交溫度。棄雜交液，用DR.洗滌液洗滌3次；于雜交室中加0.2 μL Strep-AP和 200 μL封閉液的混合液，室溫反應(yīng)30 min，棄封閉液，以DR.洗滌液洗滌3次，吸除芯片上殘留的水分；每個(gè)芯片室加 4 μL NBT/BCIP 和 196 μL DR.檢測(cè)液的混合液，置于暗室反應(yīng)5 min～10 min，棄去檢測(cè)液，水洗至雜交點(diǎn)清晰為止，用芯片反應(yīng)儀讀取結(jié)果。

1.7 芯片雜交特異性試驗(yàn) 分別用6種病原的引物，對(duì)參考病毒株和菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交，用于檢驗(yàn)各自對(duì)應(yīng)病原的特異性(表 3)。

1.8 芯片雜交靈敏度試驗(yàn) 對(duì)提取6種病原核酸定量，分別10倍倍比稀釋為7個(gè)梯度，利用各梯度核酸作為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物分別與芯片雜交，每個(gè)梯度重復(fù)雜交兩次。同時(shí)對(duì)稀釋的各模板梯度做PCR或RT-PCR和熒光PCR，與芯片的靈敏度進(jìn)行比較。PCR和RT-PCR反應(yīng)體系及條件同1.4，熒光PCR使用One Step RT-PCR試劑盒，反應(yīng)條件均為：50℃30 min；94℃ 2 min，95℃ 10 s，55℃40 s，40個(gè)循環(huán)。6種病原核酸濃度梯度分別為：AIV-H5：2.86×104pg/μL～2.86×10-2pg/μL；RV：2.25 ×104pg/μL ～2.25 ×10-2pg/μL；S.suis2：1.51×104pg/μL ～1.51 ×10-2pg/μL；B.anthracis：8.9 ×10 pg/μL ～8.9 ×10-5pg/μL；Salmonella：1.38×10 pg/μL～1.38×10-5pg/μL；E.coliO157：1.05×102pg/μL～1.05×10-4pg/μL。

1.9 樣品檢測(cè) 對(duì)禽類咽肛拭子589份、豬的鼻腔拭子185份、肉樣58份、皮革制品24份以及未注射狂犬疫苗的犬只的唾液樣品16份，提取核酸擴(kuò)增后與基因芯片雜交，分別對(duì)6種病原進(jìn)行檢測(cè)，將雜交結(jié)果與熒光PCR結(jié)果比較。

表3 特異性試驗(yàn)分組Table 3 Group of specificity test

2 結(jié)果

2.1 6種病原PCR擴(kuò)增 對(duì)AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157進(jìn)行擴(kuò)增，得到預(yù)期目的片段，表明各病原引物特異性良好。

2.2 雜交溫度優(yōu)化試驗(yàn) 將PCR擴(kuò)增的6種病原產(chǎn)物與檢測(cè)芯片分別在45℃、47℃、49℃和51℃溫度條件下進(jìn)行雜交，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在47℃時(shí)雜交信號(hào)最強(qiáng)，雜交斑點(diǎn)最清晰并且背景信號(hào)在可接受范圍內(nèi)，所以確定最佳雜交溫度為47℃(圖1)。

2.3 雜交特異性試驗(yàn) 分別使用本研究中所檢測(cè)6種病原的引物，對(duì)表3中所列的參考病毒株和菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物分別與芯片雜交檢驗(yàn)6種病原的特異性，結(jié)果表明，AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157在芯片對(duì)應(yīng)的位置上出現(xiàn)雜交信號(hào)，與每種病原相似的其他參考病原無雜交信號(hào)出現(xiàn)，表明芯片的特異性良好(圖 2)。

2.4 芯片靈敏度試驗(yàn) 分別采用芯片雜交、常規(guī)PCR和Real-time PCR 3種方法比較檢測(cè)6種病原的靈敏度?；蛐酒瑱z測(cè)AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella、E.coliO157的靈敏度分別為 2.86×10-2pg/μL、2.25×10-2pg/μL、1.51×102pg/μL、8.9×10-4pg/μL、1.38×10-5pg/μL、1.05×10-3pg/μL(圖3)。檢測(cè)結(jié)果比較表明，基因芯片的靈敏度明顯高于常規(guī)PCR 10～100倍，略高于熒光PCR(表4)。

2.5 樣品檢測(cè) 利用基因芯片對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，檢測(cè)到AIV-H5陽性0份(0/589)；E.coliO1571份(1/58)；S.suis20 份(0/185)；RV 0 份(0/16)；B.anthracis0 份(0/24)；Salmonella2 份(2/58)，結(jié)果與熒光PCR檢測(cè)結(jié)果符合為100%。

表4 3種方法檢測(cè)6種病原的最低濃度Table 4 The minimum detection concentration of three methods

3 討 論

目前，利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物傳染病所采用的顯色標(biāo)記物主要有熒光標(biāo)記和非熒光標(biāo)記兩種。本研究中對(duì)靶基因的上游引物5'端標(biāo)記了生物素Biotin，在雜交時(shí)只有PCR產(chǎn)物和探針有高度互補(bǔ)序列時(shí)出現(xiàn)雜交信號(hào)，這樣提高了雜交特異性。靈敏度最低可檢測(cè)到10-5pg/μL，不低于熒光標(biāo)記方法，略高于熒光定量PCR，高于常規(guī)PCR 10倍。但是對(duì)S.suis2的靈敏度只能達(dá)到100 pg/μL，這可能與S.suis2的基因組較大而含有靶基因拷貝數(shù)較少有關(guān)系，需作進(jìn)一步研究。而且，針對(duì)同一種方法不同病原之間其靈敏度也有所差別。特異性試驗(yàn)表明6種病原之間互不干擾，無交叉反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)上述6種病原時(shí)可以滿足實(shí)際檢驗(yàn)需要。

本研究中根據(jù)本地出入境口岸實(shí)際需要，制備了可同時(shí)檢測(cè)6種動(dòng)物源性人獸共患病病原的基因芯片并同時(shí)建立了其檢測(cè)方法。但是本實(shí)驗(yàn)尚未達(dá)到基因芯片高通量檢驗(yàn)，將需要進(jìn)一步研究。

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