訾占超，夏應(yīng)菊，韓 雪，汪葆玥，遇秀玲，翟新驗(yàn)，田克恭，倪建強(qiáng)

(中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100193)

輸血傳播病毒(Torque teno virus，TTV)是于1997年從日本肝炎患者血清中首次分離鑒定的一種新病毒[1]。TTV為無囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，目前歸類于圓環(huán)病毒科指環(huán)病毒屬[2]。TTV具有種屬專一性，不同物種間其核酸同源性較低[3]。TTV可通過輸血、血液制品、性行為、糞口途徑等方式傳播，血液、唾液、糞便、乳汁、膽汁均可帶毒。對(duì)不同人群TTV的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，一般人群的陽性率多在10%以上，呈無癥狀攜帶[4]。除感染人外，TTV還廣泛存在于各種動(dòng)物體內(nèi)[5]。豬TTV呈全球性分布流行。豬感染TTV后，一般不表現(xiàn)臨床癥狀，但有研究表明，TTV在斷奶后仔豬多系統(tǒng)綜合征(PMWS)和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)中可能會(huì)協(xié)同其他病毒致病[6]。近幾年，TTV因其普遍存在和廣泛的宿主范圍等特點(diǎn)而備受關(guān)注。

本研究通過分析分布于中國大陸29個(gè)省的豬血清樣品，比較全面地反映了當(dāng)前我國豬群中TTV的流行狀況及其與地區(qū)性分布和樣品來源的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 臨床樣品來源 2009年11月采自中國大陸的1990份生豬血清樣品。采樣范圍為除內(nèi)蒙古自治區(qū)和青海省外的29個(gè)省市自治區(qū)29個(gè)縣內(nèi)的32個(gè)規(guī)模場、48個(gè)行政村、23個(gè)屠宰場。

1.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶等購自TaKaRa公司，Trans2K Plus DNA Marker購自全式金公司，核酸提取試劑盒購自TanBead公司。

1.3 DNA模板制備 采用KingFisher公司96孔核酸提取儀進(jìn)行核酸提取，具體方法參見儀器說明書。

1.4 引物設(shè)計(jì) 分別針對(duì)TTV的兩個(gè)型設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。TTV1上游引物5'-CTCGCTTCGCTCGCACCA CG-3'， 下 游 引 物 5'-GCATAAACTCAGCCATTCG G-3'，擴(kuò)增TTV1片段長度約293 bp。TTV2上游引物 5'-AGGGTTCACCGGAAGGGCTGC-3'，下游引物5'-GCCCGATAGGCCCCTTGACTC-3'，擴(kuò)增 TTV2片段長度約352 bp。引物由上海英濰捷基公司合成。

1.5 PCR反應(yīng)體系 總體系20 μL，PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min：94℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 樣品的PCR檢測結(jié)果 利用TTV1和TTV2雙重引物對(duì)采集樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，部分樣品能擴(kuò)增出約為300 bp的TTV1片段，部分能擴(kuò)增出約350 bp的TTV2片段，部分樣品能同時(shí)擴(kuò)增出約300 bp和350 bp的片段(圖 1)。 1990份檢測樣品中，TTV1陽性樣品1112份，TTV2陽性樣品655份，TTV1和TTV2同時(shí)為陽性的樣品506份；總TTV陽性的樣品數(shù)為1261份。

2.2 豬TTV地區(qū)性分布 對(duì)各省的樣品進(jìn)行雙重PCR檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別計(jì)算出各省和各地區(qū)的 TTV1、TTV2、TTV1和 TTV2、TTV1或 TTV2感染率(表1)。各省TTV感染率示意圖圖2。各地區(qū)TTV感染率示意圖見圖3。

表1 我國各省各地區(qū)豬TTV感染率Table 1 The prevalence of swine TTV in each province and region

2.3 樣品來源與TTV流行率 采自32個(gè)規(guī)模場的568份樣品中發(fā)現(xiàn)TTV1陽性樣品327份，TTV2陽性樣品162份，TTV1和TTV2陽性樣品128份，TTV1或TTV2陽性樣品361份。采自48個(gè)行政村散養(yǎng)戶的734份樣品中發(fā)現(xiàn)TTV1陽性樣品394份，TTV2陽性樣品248份，TTV1和TTV2陽性樣品185份，TTV1或TTV2陽性樣品457份。采自23個(gè)行政村散養(yǎng)戶的688份樣品中發(fā)現(xiàn)TTV1陽性樣品391份，TTV2陽性樣品245份，TTV1和TTV2陽性樣品193份，TTV1或TTV2陽性樣品443份。規(guī)模場、散養(yǎng)戶、屠宰場豬TTV感染率，見表2及圖3。

3 討 論

豬群的TTV感染在世界上許多國家均有報(bào)道[7]。養(yǎng)殖場(戶)的豬 TTV具有較高的感染率[8]。對(duì)PMWS發(fā)病仔豬TTV的調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，患PMWS仔豬比未患PMWS的仔豬其TTV2感染率明顯較高[9]，TTV1和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)協(xié)同作用可能會(huì)引起豬的PMWS[10]；單獨(dú)感染TTV或豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)均不出現(xiàn)皮膚和腎臟的損傷，而兩種病毒混合感染豬常表現(xiàn)為皮炎腎病綜合征(PDNS)[11]。PMWS和PDNS的主要病因是PCV-2及PRRSV混合感染，而我國PCV-2感染率約為91.1%[12]，2009年的PRRSV高致病株感染率為86%[13]，均處于較高的感染水平。本研究發(fā)現(xiàn)我國豬TTV的也處于高感染率水平，TTV是否是協(xié)同PCV-2和PRRSV造成我國PMWS和PDNS高發(fā)的主要因素需要進(jìn)一步研究。

表2 樣品來源與豬TTV感染率Table 2 The prevalence of TTV and sample source

本研究通過雙重PCR檢測發(fā)現(xiàn)，我國豬群TTV的總體感染率為63.37%(1261/1990)，其中TTV1感染率為55.88%(1112/1990)，TTV2為 32.91%(655/1990)，TTV1和TTV2雙重感染率為25.43%(506/1990)。本研究中我國豬群的TTV感染率和其他報(bào)道的85.66%(221/258)和44.93%(62/138)有所不同[12,14]。考慮到采樣時(shí)間、地點(diǎn)、樣品類型、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、樣品量、樣品覆蓋面等影響因素，本研究的數(shù)據(jù)具有較強(qiáng)的代表性，總體上來說我國豬群的TTV感染率處于高水平。就地區(qū)性分布而言，TTV1的感染率華北、華東、華中、東北的數(shù)值比較接近，以華北地區(qū)為最高；TTV2感染率以東北地區(qū)最高；TTV1和TTV2雙重感染而言，東北地區(qū)最高；TTV1或TTV2的感染率也以東北地區(qū)最高；而西北地區(qū)的TTV感染率最低。我國屠宰場豬（出欄豬）的TTV感染率與規(guī)模場、散養(yǎng)戶豬的感染率的差異并不顯著，推測管理模式和豬齡并不是TTV感染率高低的關(guān)鍵因素。TTV感染率高低可能與豬在TTV環(huán)境中暴露時(shí)間有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)我國豬群TTV的感染率已經(jīng)處于較高的水平，應(yīng)該將高感染地區(qū)TTV分子流行病學(xué)調(diào)查持續(xù)進(jìn)行，分析TTV與該地區(qū)豬疫病之間的關(guān)系，監(jiān)測其是否有基因突變，毒力增強(qiáng)的可能性。同時(shí)也應(yīng)對(duì)豬TTV的功能基因及結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行研究，以期揭示TTV的感染機(jī)制及其協(xié)同致病機(jī)理。

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