田國寶，王紅寧，張安云，張 毅，楊 鑫，徐昌文

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/“985工程”西南資源環(huán)境與災(zāi)害防治科技創(chuàng)新平臺(tái)，四川成都610064)

大腸桿菌(Escherichia coli)是引起動(dòng)物腹瀉的主要病原之一，也是引起仔豬、雛禽死亡的重要原因。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，E.coli耐藥問題也越來越嚴(yán)重。β-內(nèi)酰胺類藥物是臨床常用的抗生素，占抗生素使用總量約30%～40%[1-2]。E.coli對廣譜β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥最主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶(β-Lactamases)[3]，而其中以超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)受到最為廣泛的關(guān)注。

近年來，隨著全世界對細(xì)菌耐藥問題的廣泛關(guān)注，動(dòng)物源細(xì)菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶及ESBLs研究逐漸增多[4]。而我國動(dòng)物源細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性研究很少。本研究對全國19個(gè)省97個(gè)豬場602株E.coli進(jìn)行了β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥譜系檢測、耐藥基因型分析和分子流行病學(xué)調(diào)查，為闡明我國豬源E.coli對該類藥物的耐藥現(xiàn)狀和耐藥機(jī)制，為耐藥性控制和藥物合理使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株 2006年2月～2008年12月從19個(gè)省97個(gè)規(guī)?；i場分離602株E.coli分離株。菌株鑒定結(jié)合了菌落形態(tài)特征、染色鏡檢、生化鑒定、16S rDNA序列分析和VITEK 32微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)等方法。藥敏質(zhì)控菌ATCC25922(敏感株)、ATCC35218(產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶株)購自杭州微生物有限責(zé)任公司。試驗(yàn)菌株由四川大學(xué)動(dòng)物疾病防控生物工程研究中心保存。樣品采樣分布見表1。

1.2 主要試劑和設(shè)備 抗菌藥物及藥敏紙片購自英國 Oxoid公司 (Oxoid，Basingstoke，UK)，Taq酶、100 bp DNA ladder、Maker DL-2000和DNA凝膠回收試劑盒購于天根生化科技有限公司，dNTP、培養(yǎng)基和常規(guī)化學(xué)試劑購自寶生物工程(大連)有限公司，PCR引物由上海生工有限公司合成。脈沖場電泳儀購自Bio-Rad公司。

1.3 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片法(KB法)對602株E.coli進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類和四環(huán)素類等4大類16種抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感性檢測，耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床及試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)2010[5]。

1.4 產(chǎn)ESBLsE.coli篩選 按照CLSI 2010年標(biāo)準(zhǔn)，選用藥敏紙片頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLA)、頭孢噻肟(CTX)和頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CLA)篩選產(chǎn)ESBLs菌株。結(jié)果判定：以含CLA的藥敏紙片與其相應(yīng)不含CLA的藥敏紙片抑菌環(huán)直徑的差值≥5mm確定為產(chǎn)ESBLs的菌株。

表1 602株豬源E.coli采樣分布表Table 1 Sampling distribution of 602E.coliisolates in this study

1.5 β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因PCR檢測及序列分析采用PCR方法進(jìn)行9種常見β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的檢測。設(shè)計(jì)并合成9對PCR引物(表2)。PCR反應(yīng)條件：10×buffer 2.5 μL，DNTP 2 μL，MgCl21.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，模板 DNA 0.5 μL，Taq 酶 0.25 μL，加 ddH2O 至 25 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)：94℃ 8 min； 94℃ 1 min、50℃～57℃ 55 s、72℃ 1 min，共 30個(gè)循環(huán)；最后延伸 7min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并利用BLAST軟件分析耐藥基因的亞型。

1.6 產(chǎn)ESBLs菌株脈沖場凝膠電泳(PFGE) 對部分產(chǎn)ESBLsE.coli進(jìn)行PFGE，分析菌株間同源性。PFGE電泳結(jié)果用Bionumerics 4.0(Applied Maths，Sint-Martens-Latem，Belgium)軟件進(jìn)行分析，同源性判斷標(biāo)準(zhǔn)按目前被普遍采用的Tenover標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 耐藥性檢測結(jié)果表明情況：602株E.coli分離株對氨芐西林耐藥率為88.37%，對先鋒霉素耐藥率為33.39%，對第二、第三代頭孢類藥物(頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢三嗪和頭孢噻肟)耐藥率為3.49%～10.63%，而對專用于動(dòng)物的第三代頭孢類頭孢噻呋耐藥率為11.63%，對氨曲南耐藥率為1.99%；同時(shí)，E.coli對四環(huán)素的耐藥率達(dá)97.0%，對氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星和氧氟沙星)的耐藥率約70%，對氨基糖苷類的慶大霉素耐藥率為65.8%，阿米卡星耐藥率為7.5%；但對碳青霉烯類藥物亞胺培南幾乎均為敏感(表3)。

表2 β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因擴(kuò)增引物Table 2 Primer sequences and relative information of β-lactmase genes

2.2 產(chǎn)ESBLsE.coli篩選試驗(yàn)結(jié)果 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行了產(chǎn)ESBLs菌株篩選。結(jié)果表明，本研究共從602株E.coli中鑒定出57株產(chǎn)ESBLs。

2.3 β-內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測及序列分析結(jié)果采用PCR方法進(jìn)行了9種β-內(nèi)酰胺酶基因的檢測。結(jié)果顯示，共有35株產(chǎn)blaCTX-M(其中9株產(chǎn)blaCTX-M-3，18株產(chǎn) blaCTX-M-15，9株產(chǎn) blaCTX-M-22)；共有20株產(chǎn)blaSHV(其中 8株產(chǎn) blaSHV-5；2株產(chǎn) blaSHV-11，10株產(chǎn)blaSHV-12)。此外，分別有53株產(chǎn)blaTEM-1，14株產(chǎn)blaCMY-2。沒有發(fā)現(xiàn)blaOXA-23和blaKPC型β-內(nèi)酰胺酶。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ESBLs基因的分布在不同地區(qū)存在明顯差異。四川、重慶等西南地區(qū)主要以流行CTX-M-15，CTX-M-22為主，華東地區(qū)以SHV-12為主，東北地區(qū)以SHV-5為主，廣東地區(qū)主要產(chǎn)CTX-M-22，而山東地區(qū)主要產(chǎn)CTX-M-3。

2.4 產(chǎn)ESBLs菌株脈沖場凝膠電泳(PFGE)結(jié)果對18株產(chǎn)CTX-M-15和10株產(chǎn)SHV-12的E.coli菌株進(jìn)行PFGE分型，觀察菌株間的同源性 (圖1，圖 2)。結(jié)果表明，18株產(chǎn) CTX-M-15或 10株產(chǎn)SHV-5E.coli菌株間同源性較低，分屬于不同的PFGE型別，表明我國產(chǎn)ESBLsE.coli多為零星發(fā)生或者以質(zhì)粒介導(dǎo)的形式傳播。

表3 19個(gè)省97個(gè)規(guī)?；i場602株豬源E.coli耐藥情況表Table 3 Resistance to antibiotics of 602E.coliisolates

3 討 論

本研究藥敏結(jié)果顯示，E.coli對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類和四環(huán)素類藥物耐藥率高于王紅寧等報(bào)道的結(jié)果(p<0.05)，表明隨著抗生素藥物的大量使用，細(xì)菌耐藥性越來越嚴(yán)重[7]。同時(shí)，藥敏結(jié)果顯示E.coli對青霉素類、第一、二、三和四代頭孢類藥物的耐藥率逐級(jí)遞減，顯示受試菌株對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率與藥物的出現(xiàn)與使用時(shí)間相關(guān)，藥物越新，耐藥率越低。Batchelor等報(bào)道顯示，介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥基因常常與介導(dǎo)氨基糖苷類、氯霉素類和磺胺類藥物的耐藥基因在同一質(zhì)粒上，導(dǎo)致耐藥性的共選擇(Co-selection)和共同播散，即其他藥物(如氨基糖苷類、氯霉素類或磺胺類藥物)的使用，可能會(huì)使β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性選擇出來[8]。因此，一旦耐藥細(xì)菌存在，即使臨床上不使用β-內(nèi)酰胺類藥物，其他抗菌藥物的使用同樣可以使細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥。

各個(gè)國家、地區(qū)流行的優(yōu)勢ESBLs基因型各不相同。葡萄牙動(dòng)物源性E.coli主要流行TEM-1、OXA和SHV[9]；而德國和美國情況相似[10-11]。西班牙動(dòng)物源性β內(nèi)酰胺酶多為僅具有窄譜水解活性的TEM-1、SHV-1和經(jīng)典的OXA酶[12]。香港從豬、牛及鴿子分離了產(chǎn)CTX-M-3、CTX-M-13、CTX-M-14或CTX-M-24E.coli[13]。與李家斌等報(bào)道的結(jié)果不同[14]，本研究表明我國豬源E.coli中主要流行CTX-M型和SHV型ESBLs。值得注意的是，本研究表明CTX-M-15呈現(xiàn)全國流行的態(tài)勢，而CTX-M-15也是當(dāng)前國際流行最廣危害最嚴(yán)重的β內(nèi)酰胺酶基因型，本研究發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)CTX-M-15E.coli與國際上流行的產(chǎn)CTX-M-15E.coli是否相關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

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