邵 川 魯沈源 勵雯靜 隆 玄 李善群 白春學(xué) (復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科,上海 200032)

腎臟是一個高血流量高灌注的臟器,對氧供給和氧張力的變化較敏感,因此很容易受到缺氧性損傷〔1〕,成為阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)容易累及的靶器官之一。目前對OSAHS引起腎臟損害的具體機(jī)制尚未完全闡明,相關(guān)基礎(chǔ)研究匱乏。慢性間歇低氧(CIH)是OSAHS的重要病理生理過程之一,是引起全身和局部氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。本研究通過觀察CIH大鼠腎臟組織細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化初步探討OSAHS對腎臟的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。動物艙、氣體控制通路裝置、氧濃度測量儀(靈敏度0.1%)由上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠特約制作。醫(yī)用壓縮氧氣 (濃度 ＞99.5%)、壓縮氮氣 (高純氮,濃度 ＞99.999%)、壓縮空氣由上海五鋼氣體有限責(zé)任公司充裝。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 清潔級雄性SD大鼠18只,體重140～150 g,鼠齡4周齡,隨機(jī)分對照組和CIH組,每組8只。

1.2.2 CIH動物模型的建立 將CIH組置于低氧動物艙,在氧濃度測量儀的監(jiān)測下,通過控制程序調(diào)節(jié)氧氣、氮氣的輸入流量從而調(diào)控箱內(nèi)氧濃度,氧氣、氮氣的輸入時間和順序如下:輸入純氮氣 30 s(FiO2降至7%左右)-靜息10 s-輸入純氧氣20 s(FiO2升至21%左右),每分鐘為一個缺氧循環(huán),低氧動物艙內(nèi)的氧氣濃度呈周期性波動。艙內(nèi)CO2與水蒸氣用適量鈉石灰吸收。每天8 h,持續(xù)35 d。對照組艙內(nèi)輸入空氣,其余條件同CIH組。

1.2.3 標(biāo)本采集 16.7%烏來糖(氨基甲酸乙酯)溶液0.15 ml/10 g體重腹腔注射麻醉,迅速切下左腎小塊腎皮質(zhì),在預(yù)冷的電鏡固定液中將其切成3～4塊1 mm×1 mm×1 mm的小塊置入電鏡固定液4℃保存。生理鹽水150 ml(室溫)、4%多聚甲醛(4℃)500 ml灌流固定后取右腎放入中性甲醛4℃保存。

1.2.4 HE染色 組織塊常規(guī)石蠟包埋,4 μ m切片,切片常規(guī)用二甲苯脫蠟,經(jīng)各級乙醇至水洗。蘇木素染色5 min,自來水沖洗。鹽酸乙醇分化30 s(提插數(shù)下)。自來水浸泡15 min。置伊紅液2 min。常規(guī)脫水,透明,封片。普通光鏡下觀察。

1.2.5 透射電鏡檢查 標(biāo)本按常規(guī)方法處理后,做成80 nm超薄切片,用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色法染色,在Pilipps CM120透射電鏡下觀察腎近曲小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。病變按嚴(yán)重程度分為4級:無病變(-)、輕度病變(+)、中度病變()、中度病變()。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行確切概率統(tǒng)計法。

2 結(jié) 果

2.1 組織細(xì)胞形態(tài) 對照組腎小球、近曲小管和遠(yuǎn)曲小管未見明顯異常。CIH組8例均表現(xiàn)為腎小球高度腫脹,腎球囊狹窄,球囊間隙消失(P=0.000);腎小管上皮細(xì)胞高度腫脹變性,管腔狹窄以至消失(P=0.000),遠(yuǎn)曲小管未見明顯異常,如圖1。

圖1 兩組大鼠腎臟HE染色組織病理圖(×400)

圖2 兩組大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞透射電鏡圖(×8 400)

2.2 超微結(jié)構(gòu) 對照組腎近曲小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無異常表現(xiàn)。CIH組近曲小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度的空泡變性、核膜腫脹和線粒體腫脹,其中空泡變性均為重度(P=0.000);核膜腫脹7例為中度,2例為重度(P=0.001);線粒體腫脹7例為輕度,2例為中度(P=0.000)。如表1、圖2。

表1 兩組大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(n,n=8)

3 討 論

OSAHS以反復(fù)上氣道阻塞從而導(dǎo)致間歇性呼吸暫停和低通氣為特點。臨床表現(xiàn)包括打鼾、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂、注意力和記憶力下降、情緒低落和日間嗜睡等〔2〕。近些年的研究發(fā)現(xiàn) OSAHS亦可引起血肌酐升高和尿蛋白增加〔3～5〕,此外 OSAHS也可能對腎臟的內(nèi)分泌功能產(chǎn)生影響。OSAHS對腎臟影響的具體機(jī)制尚未闡明,CIH是OSAHS的重要病理生理過程之一,是導(dǎo)致OSAHS患者體內(nèi)氧化應(yīng)激失衡和炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),推測CIH可能是OSAHS患者腎臟損害的原因之一,因此我們通過CIH動物模型,初步探討CIH對腎臟的影響,借此進(jìn)一步理解OSAHS腎臟損害的致病機(jī)制。

我們的研究發(fā)現(xiàn)腎臟組織形態(tài)在CIH的影響下已出現(xiàn)顯著的可逆性損傷,腎小球腫脹和腎球囊狹窄可能對腎小球濾過功能產(chǎn)生影響,腎小管上皮細(xì)胞腫脹和管腔狹窄也可能影響到腎小管的重吸收和分泌功能。我們推測隨著CIH時間的延長,腎臟形態(tài)學(xué)損傷將進(jìn)一步加重甚至出現(xiàn)組織細(xì)胞凋亡、壞死、間質(zhì)增生、纖維化等反應(yīng)。透射電鏡檢查發(fā)現(xiàn)CIH大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡變性、核膜腫脹和線粒體腫脹。空泡是擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹到一定程度可變成囊泡狀,即鏡下觀察到的空泡變性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞質(zhì)中由相互連通的管道、扁平囊和潴泡所組成的膜系統(tǒng),主要功能是參加蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成、加工、包裝和運(yùn)輸,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹和功能障礙將影響蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成和分泌,從而廣泛影響細(xì)胞功能。核膜是位于真核生物的核與細(xì)胞質(zhì)交界處的雙層結(jié)構(gòu)膜,它作為細(xì)胞質(zhì)同細(xì)胞核之間的界膜,對穩(wěn)定核的形態(tài)和化學(xué)成分起著十分重要的作用。核膜的主要功能包括屏障作用、控制細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的信息和物質(zhì)交換、協(xié)助染色質(zhì)(體)定位和細(xì)胞分裂以及某些生物合成的功能等。核膜腫脹將對核膜的多種功能產(chǎn)生影響甚至關(guān)系到細(xì)胞存亡。線粒體是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器,外膜平滑,內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴,兩層膜之間有腔。線粒體主要功能是將有機(jī)物氧化產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為ATP,是細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的主要場所。線粒體在細(xì)胞缺氧中毒時可變空,嵴減少或消失,體積增大,甚至破裂,即線粒體腫脹。線粒體腫脹將直接導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙,這可能是CIH大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞高度水腫的原因之一。

總之,我們的研究發(fā)現(xiàn)CIH對腎臟超微結(jié)構(gòu)、組織形態(tài)有顯著影響。本研究的不足之處是未同時設(shè)立持續(xù)低氧組和復(fù)氧干預(yù)組。持續(xù)低氧與CIH所引起的病理生理過程不同,通過比較可進(jìn)一步探討CIH導(dǎo)致腎臟損害的特點,設(shè)立復(fù)氧干預(yù)組不但可以再次驗證實驗結(jié)果,還能探討CIH腎損傷的防治機(jī)制,為持續(xù)氣道正壓(CPAP)治療OSAHS相關(guān)的腎損傷提供理論依據(jù),這些有待于我們今后進(jìn)一步研究。

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2 Lieberman JA 3rd.Obstructive sleep apnea(OSA)and excessive sleepiness associated with OSA:recognition in the primary care setting 〔J〕.Postgrad Med,2009;121(4):33-41.

3 Büchner NJ,Henning BF,H?gele KF,et al.Renal function in hypertensive patients with obstructive sleep apnea〔J〕.Dtsch Med Wochenschr,2004;129(7):305-9.

4 Michael DF,Amy Storfer Isser,H Lester Kirchner,et al.Obstructive sleep apnea is associated with increased urinary albumin excretion 〔J〕.Sleep,2007;30(7):923-9.

5 Ahmet Ursavas,Mehmet Karadag,Mustafa Gullulu,et al.Low-grade urinary albumin excretion in normotensive/non-diabetic obstructive sleep apnea patients〔J〕.Sleep Breath,2008;12(2):217-22.